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免疫系統(tǒng)對外來和自身抗原的區(qū)分不是絕對的，在某些情況下，機體免疫系統(tǒng)功能的異常，會導(dǎo)致機體攻擊自身組織，這類疾病被稱為“自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AIDs）”。AIDs在人群中的發(fā)病率極高，約7~9% [1]。目前已確定的81種AIDs[2]，根據(jù)組織受損的程度被分為：（1）器官特異性疾病，如I型糖尿病（T1DM）、多發(fā)性硬化癥（MS）、炎癥性腸病（IBD）和重癥肌無力（MG）等；（2）全身性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和Sj?gren綜合征（SS）等。
免疫系統(tǒng)攻擊自身組織，主要由T和B淋巴細胞參與，這一過程被認(rèn)為會促進疾病的進展。先前的研究表明，多種AIDs患者體內(nèi)都存在TCR異常表達。此外，在一些AIDs中發(fā)現(xiàn)了TCR庫的變化，這可能是因為外周免疫耐受遭到了破壞。正常情況下，TCR是隨機重排的，CDR3長度的分布大致為高斯分布[3]。然而，在一些AIDs中，TCR和疾病特異性CDR3克隆型的分布存在偏倚，這可能與自身抗原暴露和表位擴增有關(guān)。因此，TCR庫測序提供了研究免疫疾病的新策略，尤其是疾病特異性的主克隆可以作為生物標(biāo)志物或免疫治療的潛在靶標(biāo)，并幫助醫(yī)生監(jiān)測患者對治療干預(yù)的反應(yīng)。目前TCR庫的研究已在多種AIDs中進行，本文將以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、I型糖尿病（T1DM）這三類AIDs為例，簡單介紹TCR庫在疾病中的作用。
PART 01
系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）
系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病，主要發(fā)生于年輕女性。常見表現(xiàn)可包括多關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)炎、雷諾綜合征、面頰及其他部位皮疹、胸膜炎或心包炎、腎臟或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累以及自身免疫性細胞減少。臨床上對SLE患者的TCR庫變化進行了廣泛的研究（表1）[3]。
表1 關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡TCR庫的研究[3]
Thapa等在一項研究中利用NGS來評估11例SLE患者外周血中TCR庫多樣性的變化是否與疾病狀態(tài)相關(guān)，或是否能預(yù)測其變化[4]。每個受試者有三個樣本，分別在疾病的臨床靜止期和爆發(fā)期收集。同時選取12名年齡匹配的健康志愿者（HC）作為對照。結(jié)果如圖1所示，與健康人相比，SLE患者（處于靜止?fàn)顟B(tài)）的TCR庫多樣性減少了2.2倍（P<0.0002），tcr庫分布更不均勻（gini系數(shù)，hc vs="" p="0.015），TCR庫中擴增克隆的百分比有增加趨勢（克隆大小">1.0%，HC vs SLE, P = 0.078）。但是，在大多數(shù)SLE患者中，未觀察到總體的TCR庫多樣性與臨床疾病活動之間有顯著相關(guān)性（圖2）。因此，在不知道SLE特異性克隆的情況下，監(jiān)測SLE患者外周血中的TCR庫可能無法準(zhǔn)確預(yù)測疾病活動狀態(tài)的變化。
圖1 健康對照（HC）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者TCR庫分析[4]
注：A，通過測量每標(biāo)準(zhǔn)化血體積的克隆型數(shù)量得到的TCR庫多樣性，HC vs SLE（Mann-Whitney檢驗）；B，克隆型分布的均勻性，使用Gini系數(shù)，HC vs SLE（Mann-Whitney檢驗）
圖2 SLE患者TCR庫的縱向分析[4]
注：前50個無性系克隆型的頻率及相對排名。SLE患者的三個采樣時間點分別為靜止（Q）、爆發(fā)前（PF）和爆發(fā)（F）。從第一個樣本開始計算的時間（月）。水平紅線以上的克隆（>1%）表示高度擴增克隆（HEC）
然而，另一些研究卻得出截然不同的結(jié)果。例如，Luo等人[5]為了尋找特異性TCR α和β鏈的保守基序，并分析CDR3譜型與SLE疾病活動狀態(tài)之間的關(guān)系，分析20例SLE患者的TCR α和β鏈CDR3的譜型，結(jié)果表明CDR3譜型隨SLE疾病活動狀態(tài)的變化而呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢（圖3）。
圖3 局部分析SLE患者LYJ和LSB在治療前后TCR AV和BV家族的使用變化，以及患者LYS在4個疾病階段的所有BV家族特征
PART 02
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要累及關(guān)節(jié)的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，由細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶介導(dǎo)。對稱性外周關(guān)節(jié)炎（如腕關(guān)節(jié)和掌指關(guān)節(jié)）是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要特征，受累關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進行性破壞，并常伴有全身癥狀。科學(xué)家們在探索RA患者的TCR庫多樣性方面做出了巨大的努力（表2）。
表2 關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）TCR庫的研究[3]
Jiang等人在一項研究[6]中將來自未經(jīng)治療的RA患者和健康志愿者的外周CD4+ T細胞分成7個亞群（na?ve、效應(yīng)、中樞記憶、效應(yīng)記憶（EMT）、Th1、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞），然后通過NGS分析TCR β鏈的譜型，結(jié)果顯示（圖4和圖5），相比于健康志愿者，在RA患者的EMT和Th17細胞中發(fā)現(xiàn)了更少的TCR庫多樣性和T細胞的克隆擴增，它們具有高度相似的TCR譜型。另外，此研究還發(fā)現(xiàn)TCR庫多樣性和Th17細胞的豐度與RA疾病活動顯著相關(guān)。
圖4 RA患者的Th17和EMT細胞的多樣性低于健康對照（HC）[6]，計算D20指數(shù)（a）和Shannon指數(shù)（b）
圖5 TCRB CDR3s在RA患者的Th17和EMT細胞中高度共享[6]
注：（a）計算Th17和其他亞群之間的Jaccard指數(shù)，與健康對照(hc)相比，RA患者Th17和EMT細胞的CDR3s表現(xiàn)出更多的相似性；（b）在RA中，EMT（上）和Th17（下）克隆型的重疊頻率高于私有克隆型；（c）RA和HC重疊克隆型長度分布，RA重疊克隆型明顯長于HC重疊克隆型
此外，多項研究表明，RA患者的循環(huán)T細胞表現(xiàn)為TCR庫多樣性降低，其特異性擴增的T細胞克隆型與RA的治療耐藥性和疾病活動狀態(tài)相關(guān)[3]。
PART 03
I型糖尿病（T1DM）
I型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）主要是由于遺傳易感人群在環(huán)境因素作用下觸發(fā)自身免疫反應(yīng)破壞胰島β細胞，使胰島素分泌不足。 與SLE和RA類似，T1DM患者也發(fā)現(xiàn)TCR庫多樣性降低（表3）。
表3 關(guān)于I型糖尿病TCR庫的研究[3]
例如，Tong等人[7]為了系統(tǒng)地研究潛在的自身反應(yīng)性TCRs，使用NGS對9名T1DM患者、4名T2DM患者和6名健康對照組的T細胞進行測序。結(jié)果顯示，與T2D患者和健康對照組相比，T1D患者T細胞庫的多樣性顯著降低（圖6）。此外，T1D患者的T細胞克隆高度擴增明顯高于T2D患者和健康對照組。結(jié)果表明TCR庫多樣性分析可能成為研究糖尿病的有價值工具。
圖6 CD4+ T細胞TCRB庫的多樣性及克隆指數(shù)[7]
注：（a）產(chǎn)生的唯一序列（唯一克隆型）的數(shù)量與細胞數(shù)量相關(guān)（Spearman’s R = 0.85，p < 0.0001）。對測序數(shù)據(jù)進行歸一化，計算真多樣性指數(shù)（b）和Gini系數(shù)（c）。來自患者的TN細胞克隆性低于來自健康供體的TN細胞（Mann-Whitney U檢驗）。物種被定義為一個獨特的核苷酸序列。（d-f）真多樣性指數(shù)在TN、CM和Tscm細胞亞群之間呈正相關(guān)，與CM和Tscm從TN傳代一致（Pearson相關(guān)性）。TN，真幼稚細胞；CM，中央記憶細胞；Treg，調(diào)節(jié)性T細胞；Tscm，干細胞樣記憶T細胞
在另外一項研究[8]中，Gomez-Tourino等人通過分析來自T1DM患者和健康志愿者的循環(huán)初始、中樞記憶、調(diào)節(jié)性和干細胞樣記憶CD4+ T細胞亞群的>2×108個TCRB序列，發(fā)現(xiàn)在所有細胞亞群中，患者的TCRB的CDR3序列長度更短，在非生產(chǎn)性TCRB序列中也觀察到高頻率的短CDR3序列（圖7）。此外，與抗病毒T細胞和健康志愿者相比，由自身抗原特異性CD4+ T細胞表達的TCRB CDR3克隆型更短，表明短CDR3序列增加了自我識別的能力，從而增加了自身免疫性疾病的風(fēng)險。
圖7 在T1D患者中TCRB CDR3s較短以及具有較大的相似性[8]
注：來自（a）TN、（b）CM、（c）Treg和（d）Tscm細胞的TCRB CDR3生產(chǎn)獨特序列的核苷酸長度在患者中呈現(xiàn)偏倚的長度分布。e, f計算了14名健康供體（e）和14名T1D患者（f）的TN和CM TCRB的重疊指數(shù)。（g）TN/TN、（h）CM/CM和（i）TN/CM 細胞亞型的重疊指數(shù)（Mann-Whitney U檢驗）。*p < 0.05，***p < 0.001。線代表平均值±SD
除上述提到的幾種AIDs外，研究人員還探索了許多其他AIDs患者的TCR庫，如MS、IBD、SSc、PBC等。相關(guān)研究總結(jié)如表4 [3]。
表4 關(guān)于其他自身免疫性疾病TCR庫的研究[3]
PART 04
小結(jié)
在過去的幾十年里，人們對T淋巴細胞及其亞群在AIDs的發(fā)生和發(fā)展中的復(fù)雜而重要的作用有了更多的了解，但仍有許多未解之謎，比如TCR庫在AIDS中的細胞和分子機制。了解AIDs患者體內(nèi)的疾病特異性主克隆型有助于建立一套可靠的生物標(biāo)志物用于診斷、預(yù)測疾病狀態(tài)以及發(fā)展個性化的免疫治療。
熙寧|精翰NGS實驗室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，通過專業(yè)的生物信息學(xué)流程分析識別受體可變區(qū)，統(tǒng)計樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率，從而揭示個體的免疫表達譜。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：
熙寧|精翰NGS平臺可提供的檢測服務(wù)
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以慢病毒為載體的CAR-T細胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風(fēng)險；
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通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預(yù)后，提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù)；
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通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉(zhuǎn)運、代謝和相關(guān)信號通路的基因變化，從而指導(dǎo)患者入排，發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點和生物標(biāo)志物，并指導(dǎo)耐藥機制研究和新的治療策略開發(fā)；
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評估候選藥物對基因表達的影響，篩選出對特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達變化，優(yōu)化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。
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參考文獻：
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