中文
靶向蛋白質(zhì)降解(TPD)目前主要通過(guò)泛素蛋白酶體和溶酶體降解目標(biāo)蛋白，根據(jù)具體作用原理又可細(xì)分為近10個(gè)不同技術(shù)路線(xiàn)，其中發(fā)展最快的是分子膠和PROTAC技術(shù)。
圖1 靶向蛋白質(zhì)降解(TPD)不同的技術(shù)路線(xiàn)
分子膠 VS PROTAC：
?
分子膠不需要與POI存在親和力。
?
分子膠在成藥性上優(yōu)于PROTAC。
?
分子膠大多數(shù)是偶然發(fā)現(xiàn)的，而PROTAC可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)。
圖2 分子膠 VS PROTAC
PART 01
全球范圍內(nèi)分子膠和PROTAC藥物研發(fā)情況概覽
全球分子膠藥物研發(fā)情況
目前研發(fā)的新藥大多通過(guò)E3的組成分子CRBN來(lái)降解蛋白質(zhì)，主要用于MM、血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體惡性腫瘤等疾病治療。從作用機(jī)制來(lái)看，IKZF1/3是其中最熱門(mén)的作用靶點(diǎn)，GSPT1、DCAF15、IKZF2、BCL-xL、SEL1L2等新靶點(diǎn)也陸續(xù)被開(kāi)發(fā)。
圖3 全球分子膠藥物研發(fā)情況（不完全統(tǒng)計(jì)）
全球PROTAC藥物研發(fā)情況
圖4 全球PROTAC藥物研發(fā)情況（不完全統(tǒng)計(jì)）
PART 02
流式細(xì)胞術(shù)在分子膠和PROTAC藥物PD檢測(cè)中的應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù)在SP-3164 PD研究中的應(yīng)用
SP-3164是一種阿伐度胺（AVA, CC-122）的氘穩(wěn)定（S）對(duì)映異構(gòu)體，同時(shí)也是一種可口服的分子膠，用于降解Ikaros和Aiolos（I/A）。相關(guān)體外研究數(shù)據(jù)表明其在多發(fā)性骨髓瘤臨床前模型中具有活性，與來(lái)那度胺（LEN）、泊馬度胺（POM）和阿伐度胺（AVA）相比，SP-3164更有效、更快速地降解促癌轉(zhuǎn)錄因子I/A，而穩(wěn)定的（R）-對(duì)映異構(gòu)體SP-3165既不結(jié)合CRBN也不降解I/A。在初步的體內(nèi)研究中，SP-3164產(chǎn)生了顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制（TGI）。
將SP-3164降解MM.1S細(xì)胞中Aiolos的潛力與SP-3165、AVA和POM進(jìn)行了比較。SP-3164以時(shí)間和劑量依賴(lài)性方式快速而有力地降解Aiolos，比AVA和POM更有效，而SP-3165表現(xiàn)出最弱的Aiolos降解。為了研究SP-3164對(duì)細(xì)胞存活的影響，用SP-3164（0.1μM、1μM和10μM）和SP-3165（1μM）處理NCI-H929細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡。SP-3164在72小時(shí)后誘導(dǎo)劑量依賴(lài)性早期和晚期細(xì)胞凋亡，而SP-3165未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在NCI-H929小鼠異種移植模型中評(píng)估SP-3164的體內(nèi)活性并與SP-3165、LEN和POM進(jìn)行比較。SP-3164作為單一藥物顯示出顯著的TGI，而SP-3165似乎支持腫瘤生長(zhǎng)。LEN和POM表現(xiàn)出最弱的TGI。與POM+DEX聯(lián)合使用相比，SP-3164與地塞米松（DEX）聯(lián)合使用時(shí)，TGI有所改善。
同時(shí)，SP-3164可以有效降解Ikaros和Aiolos（I/A），在臨床前NHL模型中顯示出令人信服的活性。
流式細(xì)胞術(shù)在NVP-DKY709 PD研究中的應(yīng)用
NVP-DKY709，一種IKZF2（Helios）轉(zhuǎn)錄因子的選擇性降解物，不降解IKZF1/3。研究表明，NVP-DKY709在體外可降低人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用，并使耗竭Teff分泌細(xì)胞因子，降低小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，并降解猴子和人體內(nèi)的IKZF2。
① 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)體外評(píng)估DKY709對(duì)T細(xì)胞和Tregs細(xì)胞的影響。
圖5 A．D&E的圈門(mén)策略； B．人原代Treg細(xì)胞體外孵育10μM DKY709或DMSO的數(shù)據(jù)，包括%IKZF2+和IKZF2 MFI；C．人原代Treg細(xì)胞在DKY709作用下會(huì)擴(kuò)增，并抑制Teff細(xì)胞增殖；D&E不同濃度DKY709作用于重復(fù)TCR刺激誘導(dǎo)的功能失調(diào)的Teff細(xì)胞，IKZF2+以及IL-2和IFN-γ水平的變化
② 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估小鼠和食蟹猴給藥DKY709對(duì)T細(xì)胞和Tregs細(xì)胞的影響。
圖6 A. B的圈門(mén)策略；B. 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定單次口服DKY709后食蟹猴血液中Treg細(xì)胞中IKZF2水平；C. 每日給予KLH免疫的食蟹猴指定劑量的DKY709后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血CD3+細(xì)胞中Ki67的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估外周血T細(xì)胞的增殖能力
圖7 A. B&C的圈門(mén)策略；B. 人源化小鼠MDA-MB-231腫瘤移植模型中IKZF2在原代Foxp3+ Treg細(xì)胞中的體內(nèi)降解，血液(左)和腫瘤浸潤(rùn)(右)；C. 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估DKY709和PD1阻斷治療對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞Foxp3 MFI和CD25表達(dá)和增殖的影響
③ 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估臨床DKY709藥效
圖8 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估兩例在指定時(shí)間內(nèi)每天接受20mg DKY709患者外周血Tregs中IKZF2的水平
流式細(xì)胞術(shù)在ARCC-29 PD研究中的應(yīng)用
ARCC-29是一種蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）分子，它通過(guò)蛋白酶體誘導(dǎo)BET（BRD4/3/2）蛋白降解。ARCC-29 在幾種人類(lèi)惡性細(xì)胞系和體內(nèi)嚙齒動(dòng)物異種移植腫瘤中降解BRD4。在前列腺（22Rv1）、DLBCL（SU-DHL-6）和卵巢（A2780）腫瘤的小鼠異種移植模型中，該分子表現(xiàn)出很強(qiáng)的PK/PD/療效關(guān)系。從患者身上獲取腫瘤組織通常需要侵入性操作，并且可能無(wú)法獲得。已有相關(guān)研究開(kāi)發(fā)了一種使用替代組織的檢測(cè)方法來(lái)評(píng)估PROTAC的作用機(jī)制，這些機(jī)制可以應(yīng)用于臨床，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)定量評(píng)估外周血單核細(xì)胞（PBMC）各亞群中BRD4的水平。將冷凍或新鮮的人PBMC與ARCC-29離體培養(yǎng)6小時(shí)，固定并透化以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)BRD4染色，并在門(mén)控淋巴細(xì)胞中定量BRD4水平。ARCC-29在四個(gè)新鮮PBMC樣品中將BRD4水平降低到對(duì)照的13%、10%、16%和9%，在六個(gè)冷凍PBMC樣品中降低到10%、9%、11%、6%、8%和35%，與BRD4抑制劑OTX-015作用PBMC顯示出相似或更強(qiáng)的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC為治療前和治療后的患者樣本在臨床上確認(rèn)PROTAC的作用機(jī)制提供了潛在的替代方法。
PART 03
熙寧生物|精翰生物凍存全血專(zhuān)利助力分子膠和PROTAC藥物臨床PD檢測(cè)
表1 FACS熙寧|精翰部分凍存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)展示
凍存穩(wěn)定性總結(jié)：
?
-70℃凍存3個(gè)月，與基線(xiàn)相比，各亞群的靶蛋白1的抑制率%CV范圍為：2.8%-13.6%。
?
-70℃凍存3個(gè)月，與基線(xiàn)相比，各亞群的靶蛋白2的抑制率%CV范圍為：7.5%-11.5%。
?
-70℃凍存3個(gè)月，與基線(xiàn)相比，各亞群的占比%CV范圍為：0.5%-7.8%。
圖9 各細(xì)胞亞群抑制率（％）
FACS熙寧|精翰部分臨床樣品數(shù)據(jù)展示。分別在給藥前D1-Pre，給藥后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)全血樣品中各細(xì)胞亞群靶蛋白抑制率，給藥后有明顯抑制
表2 FACS檢測(cè)胞內(nèi)/核內(nèi)因子相關(guān)案例經(jīng)驗(yàn)
熙寧|精翰生物流式平臺(tái)，不斷進(jìn)行技術(shù)迭代，開(kāi)發(fā)創(chuàng)新。針對(duì)流式分析血液樣品穩(wěn)定性時(shí)間短，需要及時(shí)運(yùn)輸；或者是需要在臨床中心分離PBMC，耗時(shí)耗力，效果不佳等行業(yè)痛點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了全血直接凍存技術(shù)，目前已獲得國(guó)家專(zhuān)利授權(quán)，提高了各方的運(yùn)營(yíng)效率，減小了數(shù)據(jù)的批間差異，提高了數(shù)據(jù)的可比性，為行業(yè)創(chuàng)造了價(jià)值，受到了來(lái)自申辦方和臨床試驗(yàn)中心的一致歡迎和好評(píng)；為國(guó)際多中心臨床樣品的流式檢測(cè)，提供了解決方案。基于全血凍存技術(shù)，熙寧|精翰開(kāi)展了一系列的應(yīng)用拓展，包括但不限于：
基于凍存全血的靶點(diǎn)降解檢測(cè)
穩(wěn)定性預(yù)計(jì)至少3個(gè)月
基于凍存全血的淋巴細(xì)胞亞群比例檢測(cè)
穩(wěn)定性可達(dá)12個(gè)月；
基于凍存全血的淋巴細(xì)胞亞群比例和
絕對(duì)計(jì)數(shù)檢測(cè)
穩(wěn)定性預(yù)計(jì)可達(dá)至少6個(gè)月
基于凍存全血的受體占位檢測(cè)
（受體占位靶點(diǎn)包括PD-1,PD-L1, TIGIT, PVRIG, CD19,CD20, CD33, CD38, CD39, CD47, CD73等）
穩(wěn)定性可達(dá)6-12個(gè)月
熙寧|精翰流式細(xì)胞團(tuán)隊(duì)由30余名經(jīng)驗(yàn)豐富的人員組成，配備BD流式細(xì)胞儀、Beckman流式細(xì)胞儀、Cytek光譜流式細(xì)胞儀等儀器和設(shè)備，支持過(guò)包括抗體類(lèi)藥物、基因與細(xì)胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類(lèi)新藥的流式分析檢測(cè)，其中抗體藥物>40個(gè)，基因與細(xì)胞治療藥物>50 個(gè)，小分子創(chuàng)新藥>20 個(gè)，臨床試驗(yàn)>100 個(gè)，更是支持國(guó)內(nèi)第一款I(lǐng) 類(lèi)新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達(dá)?（瑞基奧侖賽注射液）的樣本檢測(cè)分析工作。平臺(tái)能夠支持包括免疫細(xì)胞亞群分型檢測(cè)，細(xì)胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析，抗體藥物的受體占位分析，PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化檢測(cè)，胞內(nèi)因子檢測(cè)等。尤其在血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中具有大量的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，歡迎咨詢(xún)溝通。
參考文獻(xiàn)：
[1] Zhao L, Zhao J, Zhong K, et al. Targeted protein degradation: mechanisms, strategies and application[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022, 7(1): 113.
[2] Sasso J M, Tenchov R, Wang D S, et al. Molecular glues: The adhesive connecting targeted protein degradation to the clinic[J]. Biochemistry, 2022, 62(3): 601-623.
[3] LIU S, DOU S, WANG J, et al. Market Analysis and Countermeasures for Targeted Protein Degradation Drugs[J]. China Biotechnology, 2023, 43(2/3): 190-200.
[4] Duncan, Aundrietta D., et al. "SP-3164, a novel molecular glue degrader with activity in preclinical models of multiple myeloma." Cancer Research 83.7_Supplement (2023): 6253-6253.
[5] Santiesteban D, Duncan A D, Mirza N Q, et al. P1241: A NOVEL CEREBLON-BINDING MOLECULAR GLUE, SP-3164, SHOWS PRECLINICAL ACTIVITY IN NON-HODGKIN LYMPHOMAS[J]. HemaSphere, 2023, 7(S3): e95971dd.
[6] Bonazzi S, d’Hennezel E, Beckwith R E J, et al. Discovery and characterization of a selective IKZF2 glue degrader for cancer immunotherapy[J]. Cell Chemical Biology, 2023, 30(3): 235-247. e12.
[7] Solomon J, Bonazzi S, d'Hennezel E, et al. Targeted degradation of IKZF2 for cancer immunotherapy[J]. 2022.
[8] Gough S M, Raina K, Gordon D, et al. IHC and flow cytometry quantifies BRD4 levels in surrogate tissues after ex-vivo and in-vivo dosing with a BRD4 degrading PROTAC[J]. Cancer Research, 2017, 77(13_Supplement): 5076-5076.
