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上文熙寧小課-第146期 | 免疫組庫測序打開藥物研發新視野（五）：TCR免疫組庫測序在腫瘤免疫治療中的應用（上）以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個樣本的TCR免疫組庫測序結果進行了簡單展示。
本文將對受檢者*經治療后的不同時間節點的樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，對每個樣本 TCR 的克隆比例、克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進行統計，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標的動態變化，如克隆總數、克隆類型、多樣性指數、克隆豐度等，以TRB為例進行展示（注：圖示中所有數據均來自虛擬樣本）。
PART 01
免疫監測為腫瘤免疫治療提供臨床指導
在腫瘤免疫治療中，通過 TCR 免疫組庫測序追蹤同一個患者在不同時間節點的T細胞克隆類型與比例變化，可以提供非常重要的臨床信息和指導意義：
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治療反應監測：觀察到特定的TCR克隆在治療前后或治療期間的相對穩定或顯著擴增，可能指示這些克隆對應T細胞具有有效的抗腫瘤活性，這對于評估免疫治療效果至關重要。若治療后這些效應T細胞克隆比例上升，則提示治療起效，反之則可能提示治療失敗或耐藥；
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免疫監測與復發預警：如果治療后原本消失或減少的腫瘤相關TCR克隆再次升高，可能預示著腫瘤復發或進展。通過實時監測TCR譜的變化，可以提前發現病情變化，指導臨床決策；
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治療反應預測：識別出患者體內預先存在的抗腫瘤TCR克隆，可以預測患者對某些免疫療法（如免疫檢查點抑制劑、T細胞受體工程改造療法等）的響應可能性；
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免疫逃逸機制研究：分析腫瘤微環境中TCR克隆的動態變化，有助于揭示腫瘤如何通過免疫編輯過程實現免疫逃逸，從而改進現有治療策略，開發新的治療手段。
PART 02
時序樣本TCR免疫組庫測序結果
注：下圖中的樣本信息和結果均來自模擬數據
2.1 樣本間共有克隆分析
統計多個樣本的共有克隆的數目，結果見圖1，根據多個樣本的CDR3序列及頻率繪制聚類熱圖，結果見圖2。
圖1 多個樣本克隆類型一致性venn圖
上圖為多個樣本中克隆類型一致性分布的韋恩圖。該圖支持2~5個樣本的可視化，圖中的數字表示重疊樣本的共有克隆的數目。
圖2 多個樣本共有克隆表達量聚類熱圖
上圖為不同樣本的克隆頻率聚類熱圖，其中，每一列為一個樣本，每一行為一種克隆。按克隆類型進行聚類，反應樣本間的克隆分布的相似性。藍色表示該克隆在對應樣本中克隆頻率較高，黃色表示該克隆在對應樣本中克隆頻率較低。
不同樣本中可能存在相同的克隆，依據克隆在樣本中共同存在的情況，有助于分析組間、組內的差異和共性，有助于分析尋找疾病特異性克隆。
如果一個或幾個特定的T細胞克隆在治療前后的不同樣本中持續存在且比例增加，這可能表明這些克隆具有針對腫瘤的有效免疫反應。特別是在免疫治療后，同一克隆的增多可能代表這些T細胞成功地識別并消滅了腫瘤細胞，提示治療有效。
若在治療后較長時間內，仍然能在患者體內檢測到相同的效應T細胞克隆，尤其是那些腫瘤特異性T細胞克隆，這可能意味著患者已經建立了持久的免疫記憶，有利于防止腫瘤復發。
相反，若治療后，原本預期應被激活的特定克隆并未顯著擴增或反而減少，這可能暗示腫瘤出現了免疫逃逸機制或者患者對當前治療不敏感，提示治療可能無效或產生了耐藥性。
2.2 樣本間 V/J 基因使用頻率分析
統計每個樣本中 V，J 基因的使用頻率，結果見圖3 與圖4。
圖3 不同樣本V基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 V 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 V 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
圖4 不同樣本J基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 J 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 J 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
當免疫治療有效時，通常伴隨著腫瘤特異性T細胞的激活和擴增。這些T細胞可能具有特定的TCR結構，其V和J基因的使用頻率會在治療后顯著增加。因此，如果發現某些V/J基因組合的頻率在治療后有所升高，可能說明這些T細胞正積極地參與對抗腫瘤，從而提示治療效果良好。
另一方面，如果預期應該對治療產生反應的特定V/J基因使用頻率未見明顯上升，甚至減少，可能提示腫瘤正在通過免疫逃逸機制躲避T細胞攻擊，或者治療未能有效激活相應的抗腫瘤T細胞克隆，從而提示治療效果不佳或產生耐藥性。
2.3 多時間節點動態分析
由于樣本存在時序關系，為展示不同時間點樣本間 TCR 重組序列的變化情況，對多個樣本的克隆數、克隆類型、多樣性指數、克隆分率分布等進行統計，見圖5-7，篩選了每個樣本表達量最高的前20條克隆組成新的克隆群，追蹤該克隆群體在不同樣本間克隆頻率的變化，見圖8。
圖5 不同時間節點樣本高頻克隆的TCR指標動態變化折線圖
上圖為不同時間節點樣本的 TCR 克隆數統計圖。X軸為不同時間節點的樣本，柱形圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆類型與克隆總數，Y軸為Log10（克隆數）。
圖6 多樣性指數變化折線圖
上圖為不同時間節點樣本的 TCR 多樣性指數統計圖。X軸為不同時間節點的樣本，折線圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆克隆多樣性指數。
圖7 不同樣本的克隆豐度組成累計頻率分布圖
上圖為多個樣本的克隆豐度的密度分布圖。其中 X 軸 Log10(克隆頻率)， Y 軸表示處于該區間的克隆頻率的百分比。反應不同樣本的克隆豐度組成變化情況。
圖8 不同時間節點樣本高頻克隆的頻率變化追蹤圖
上圖為時序樣本特定克隆的堆疊面積圖，其中，X軸表示不同的時間節點（不同樣本），陰影面積的大小反應克隆頻率的大小。不同樣本間的共有克隆由相同的顏色表示。
在腫瘤免疫治療中，不同樣本中T細胞克隆的豐度和多樣性指數的變化能夠從一定程度反映腫瘤治療的臨床效果。
有效的免疫治療可能導致T細胞庫的多樣性增加，這是因為有更多的腫瘤特異性T細胞被激活和擴增，增加了整體T細胞克隆的多樣性，這是免疫系統響應的一種積極信號；在某些情況下，治療后T細胞多樣性降低可能是因為少數高效應T細胞克隆占據了優勢，這在一定程度上可能反映出了治療的成功，但如果整體多樣性降低過于顯著，也可能提示免疫系統整體功能受限或偏向單一反應，不利于長期控制腫瘤；對于免疫衰老或腫瘤導致的T細胞多樣性喪失，治療后多樣性趨于穩定或恢復，可能表明治療有助于重建健康的免疫平衡，有利于治療效果的持久性。
通過全面分析克隆豐度和多樣性指數的變化，可以幫助臨床醫生評估治療策略的有效性、預后以及耐藥性，同時也為個體化治療方案的制定提供了科學依據。
2.4 TILs 來源的克隆殘留比例追蹤
在腫瘤微環境中，TILs的克隆組成反映了機體對腫瘤的免疫反應強度和特異性。在 TILs（Tumor-Infiltrating Lymphocytes） 介導的腫瘤免疫治療過程中對TILs在血液和腫瘤組織中的殘留量、活性和克隆分布的連續監測有助于了解治療效果和調整后續治療策略。
圖9 樣本TILs來源的TRB克隆殘留比例折線圖
上圖為樣本TILs 來源的 TRB 克隆殘留比例折線圖，其中，X軸表示不同的時間節點（不同樣本），縱坐標表示克隆殘留比例（%）。
TILs 注射后在患者體內的殘留比例變化取決于多種復雜因素，包括體內歸巢與增殖、免疫抑制微環境、免疫抑制劑的聯合使用、TILs的質量和純度、患者個體差異等，這些因素相互作用影響TILs在體內的持久性、增殖能力、抗腫瘤活性以及最終的治療效果。
2.5 樣本相似性計算及聚類
當樣本數>3時，統計樣本間的克隆序列分布相似性指數：Morisita’s overlap index。根據相似性對樣本進行聚類，結果見圖10。Morisita 重疊指數的計算公式為：
xi 是克隆 i 在一個克隆總數為 X 的樣本中出現的次數。
yi 是克隆 i 在一個克隆總數為 Y 的樣本中出現的次數。
S 是克隆類型總數。
圖10 多樣本相似性聚類樹狀圖
上圖展示了多個樣本的樹狀結構，分支長度顯示了樣本克隆序列之間的距離。
不同治療組間的聚類可以區分出對治療響應良好和不良的患者群體，通過比較治療前后的TCR譜系變化，可以判斷治療是否有效激活了腫瘤特異性T細胞反應；不同類型的腫瘤或疾病階段具有獨特的TCR譜系特征，聚類分析可以幫助細化疾病分型，甚至預測疾病進展或轉歸；分析腫瘤樣本和正常對照之間的TCR克隆差異，可以識別出可能與腫瘤免疫逃逸相關的TCR克隆，從而深入了解腫瘤如何規避免疫監視。多組樣本TCR免疫組庫測序的樣本聚類分析有助于深入了解免疫系統在腫瘤發病和治療過程中的動態變化，為臨床提供更精準的診斷、預后判斷以及個體化治療方案設計。
PART 03
小結
免疫組庫檢測方法揭示了免疫系統多樣性和克隆擴增狀態，除了用于腫瘤的免疫治療外，還可用于研究病原體感染過程中宿主免疫反應的多樣性、識別關鍵抗體序列；探究自身免疫疾病的發病機制及其潛在治療靶點；研究移植后宿主對移植物的免疫反應，為優化移植后免疫抑制方案提供依據。由此可知，免疫組庫檢測技術已經成為現代生物醫藥研發的重要工具，不僅促進了免疫療法的進步，也在多種治療領域發揮了關鍵作用。
熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，在時序樣本檢測中，通過檢測患者體內TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進展或復發。本檢測方法已經經過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據CAP質量的要求，建立了完善的質量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發的各個環節發揮重要作用：
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以慢病毒為載體的CAR-T細胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風險；
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通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預后，提前提示復發風險并指導后續干預；
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通過基因組和轉錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關聯的基因突變、融合突變和拷貝數變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉運、代謝和相關信號通路的基因變化，從而指導患者入排，發現藥物研發的潛在靶點和生物標志物，并指導耐藥機制研究和新的治療策略開發；
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評估候選藥物對基因表達的影響，篩選出對特定靶標有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達變化，優化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。
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