中文
系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）是一種以廣譜自身抗體沉積、多器官炎性損傷為特點，臨床異質性顯著的慢性自身免疫性疾病。SLE發(fā)病幾乎累及人體各器官、組織和系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)復雜多樣，好發(fā)于育齡期女性，女性發(fā)病年齡多為15~40歲，女：男約為7~9∶1。SLE的發(fā)病率和患病率在不同種族人群中具有一定差異，亞洲及太平洋地區(qū)SLE的每年發(fā)病率約為每10萬人中有2.5~9.9個，每年患病率約為每10萬人中有3.2~97.5個[1]。目前SLE已由既往的急性、高致死性疾病轉為慢性、可控性疾病，但仍沒有根治的方法。臨床強調早發(fā)現(xiàn)、早干預、早治療，治療方式主要為對癥治療和防治感染，以達到控制疾病活動、緩解病情、避免或延緩不可逆的組織臟器的病理損傷等目的。
PART 01
SLE的發(fā)病機制
SLE發(fā)病機制復雜，且尚未完全闡明，目前仍認為是遺傳、表觀遺傳、免疫、代謝、雌激素和環(huán)境因素等多因素綜合作用的結果。
Toll樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因突變，導致TLR7選擇性地增加對鳥苷和2',3'-cGMP的親和力，使得TLR7活化增強，誘導SLE發(fā)病。該模型成功在小鼠體內引發(fā)狼瘡，由此確認該基因是SLE的致病基因[2]。
圖1 TLR7結構圖
注：左圖為正常的TLR7結構圖，右圖為突變后的TLR7結構圖。突變發(fā)生在位點Y264處，突變?yōu)镠264。中心的網狀區(qū)域結構為鳥苷，突變后的TLR7可以與鳥苷形成更多的氫鍵。根據(jù)分子動力學的模擬結果，這提升了二者之間的親和力。
TLR7可以通過影響B(tài)細胞活化的兩種途徑，來誘使免疫系統(tǒng)產生自身反應性抗體分泌細胞，進而導致SLE的發(fā)生[3]。
圖2 TLR 通過不同的途徑驅動SLE患者的漿細胞分化
Johanna K Sandling等人的研究表明，T細胞通路與SLE相關性最強，JAK-信號轉導和轉錄激活因子（Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT） 通路相關的基因突變，會導致人類白細胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）和IFN異常，進而增加SLE易感性[4]。除此以外，巨噬細胞、中性粒細胞、漿細胞樣樹突狀細胞等免疫細胞也被認為與SLE患者的病理相關[5]。
50%~75%的SLE患者均存在IFN-Ⅰ升高或IFN調節(jié)基因表達的增加[6]。根據(jù)已有的研究證據(jù)所建立的SLE病理模型，靶器官內的干擾素Ⅰ可能有多種來源，可能決定了SLE的臨床表型和對治療的抵抗力。但是非循環(huán)、非造血系統(tǒng)所長期產生的IFN-Ⅰ，在SLE的發(fā)病和發(fā)展中起主導作用[7]。
圖3 I型干擾素在SLE進展階段的作用機制模型
PART 02
SLE的分類標準和評估方式
自從1982年，美國風濕病學會（ACR）正式發(fā)布系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）分類標準以來，至今已經40多年。在此期間，ACR于1997年修訂了SLE標準[8]；SLE國際臨床協(xié)作組（SLICC）于2012年發(fā)布了SLE分類標準[9]；20歐洲風濕病聯(lián)盟（EULER）與ACR于2019年聯(lián)合發(fā)布了SLE分類標準[10]。SLE分類標準的變遷，主要體現(xiàn)在：重視腎臟病理、重視免疫學指標、重視早期診斷和重視更新流行病方法學。目前，2019年EULAR與ACR聯(lián)合發(fā)布的SLE分類標準的敏感度為96%，特異度為93%，是全球金標準。雖然上述分類標準的更新和優(yōu)化表明學界對SLE的理解在逐步加深，免疫學檢測方法在不斷優(yōu)化，但SLE分類標準終究只是分類標準，并不是決定患者個體診斷的標準，并未徹底突破其局限性[11]。
對于已確診的SLE患者，臨床需要定期對其SLE疾病活動度進行評估。目前常用的評估工具有：英國狼瘡評估小組（BILAG-2004）、SLE疾病活動指數(shù)（SLEDAI-2000）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度評分（SLE-DAS）[12]等。目前國內臨床實踐中，常采用SLEDAI-2000來對疾病活動度進行分級，再結合臨床醫(yī)師的整體判斷（Physician Global Assessment，PGA），參照SLE患者的臨床表現(xiàn)和其它表現(xiàn)對疾病活動度進行準確評估[13]。
圖4 2019年EULAR與ACR聯(lián)合發(fā)布的SLE分類標準
表1 SLE疾病活動指數(shù)（SLEDAI-2000）評分表
PART 03
SLE相關生物標志物介紹
隨著SLE的相關研究不斷深入，免疫學異常越來越受到重視。在臨床中，一旦患者出現(xiàn)免疫學異常，即使臨床診斷不夠確診SLE的條件，也應密切隨訪，以便盡早做出診斷和及時治療。
免疫學異常主要體現(xiàn)在抗核抗體方面。抗核抗體(ANA，Anti Nuclear Antibodies)是一組將自身真核細胞的細胞核、細胞漿、細胞骨架及細胞分裂周期蛋白等作為靶抗原的自身抗體的總稱，并不是單一成分。ANA的性質主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，無器官和種屬特異性，主要存在于血清中，也可存在于胸腔積液、關節(jié)滑膜液和尿液中。健康體檢人群中ANA陽性率高達11.27%，大部分為生理性自身抗體[14]。抗核抗體檢測包括抗核抗體總抗體的檢測（后續(xù)以ANA代指）和針對靶抗原的特異性自身抗體檢測（后續(xù)以抗核抗體譜或ANAs代指），二者各有不同的臨床應用優(yōu)缺點。ANA陽性常見于SLE患者，檢測敏感性好，故ANA檢測常用于SLE高危人群的篩查。由于受限于技術和對ANA的認知，目前抗核抗體譜所檢測的特異性自身抗體僅占抗核抗體中的一小部分，因此抗核抗體譜的檢測不如ANA檢測全面，但其疾病特異性強，如抗Sm抗體，疾病特異性高達99%，且部分特異性自身抗體與疾病活動性密切相關，如抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體。故在臨床應用中，ANA和抗核抗體譜的檢測一般需要同時進行。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡極易攻擊患者腎臟，腎臟活檢雖然是確診狼瘡腎炎的金標準，但不易定期檢查。臨床常采用檢查患者的24小時尿蛋白含量或尿蛋白肌酐比等方式，來監(jiān)測患者的腎臟功能。
除此以外，SLE患者還常出現(xiàn)類風濕因子（RF）和γ球蛋白升高、補體下降、凝血功能異常等現(xiàn)象。針對上述指標進行定期監(jiān)測可以快速準確地對疾病進行分類和對病情進行評估。
隨著病情的發(fā)展，SLE患者的心臟、肺臟、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腎臟、神經系統(tǒng)等均會出現(xiàn)不同程度的損傷，甚至產生狼瘡危象。故在疾病發(fā)展過程中，還應該對相關系統(tǒng)的生物標志物進行監(jiān)測，及時對癥治療，避免病情加重，進入狼瘡危象。
PART 04
ANA的檢測方法
ANA的檢測方法包括間接免疫熒光法（IIF法）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、線性免疫印跡法（Line Immunoassay,LIA）、化學發(fā)光免疫分析法（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA）、流式熒光發(fā)光法等多種免疫學方法[15]。但以HEp-2細胞為實驗基質的IIF法是進行ANA檢測的參考方法和首選方法，對SLE的診斷敏感性為95%，特異性為65%。如果臨床高度懷疑SLE，而其他方法檢測ANA結果為陰性時，必須采用IIF法重新檢測ANA[16]。
間接免疫熒光法的檢測原理是：先在生物載片的反應區(qū)上固定包被基質，即HEp-2細胞。隨后將樣品與生物載片共同孵育，樣品中的抗核抗體（主要是IgG），與包被基質上的靶抗原相結合，形成結合在生物基質上的抗體-抗原復合物。經過反復清洗，去除未結合的樣品后，加入熒光素標記的抗人抗體，一般為異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗人IgG，與結合在生物基質上的抗體-抗原復合物中的抗體端孵育反應，形成二抗-抗體-抗原免疫復合物。若樣品中含抗核抗體，則形成的復合物上的FITC在熒光顯微鏡的488nm激發(fā)光激發(fā)下，會產生可被肉眼觀察到的綠色熒光。若樣品不含抗核抗體，則不形成免疫復合物，也不顯示特異性熒光。
由于不同樣品之間的抗核抗體組成不完全相同，其對應的靶抗原在細胞內的分布也不同，因此熒光產生位置不同，由此產生了不同的熒光模型。根據(jù)第2屆ICAP 達成的共識[17]及我國ANA檢測的臨床實踐現(xiàn)狀，熒光模型分為3類：細胞核熒光模型（14種）、細胞漿熒光模型（9種）和細胞有絲分裂熒光模型（5種）。
除了特異性熒光模型外，抗體滴度也是該檢測方法的判斷結果之一。樣品反應產生的特異性熒光會隨著樣品稀釋倍數(shù)的提升而逐漸下降，直至消失。其中特異性熒光消失前的樣品最大稀釋倍數(shù)即是該樣品的滴度。目前ANA滴度（量值）與疾病相關性無明確定論，但樣品滴度值大于參考范圍（標準為1:80）是SLE分類標準中的入組標準。
當前存在兩種樣品稀釋方式，一種是傳統(tǒng)倍比稀釋系統(tǒng)，一般滴度匯報形式為1：40、1：80、1：160等；一種是10開方稀釋系統(tǒng)，一般滴度匯報形式為1：100、1：320、1：1000等。我國臨床ANA滴度檢測與匯報現(xiàn)狀較為復雜，上述兩種稀釋系統(tǒng)和滴度匯報形式常常相互混雜。但不同檢測試劑在不同稀釋系統(tǒng)下所得到的滴度值，不可以進行直接比較。一般來說，適用于10開方稀釋系統(tǒng)的試劑，靈敏度更好，性能更優(yōu)。
除此以外，目前間接免疫熒光法通常采用HEp-2細胞和靈長類肝臟冰凍組織切片兩種基質，來聯(lián)合檢測患者樣品中的ANA。一方面是由于SLE患者的ANA濃度較高，以HEp-2細胞為包被基質的檢測方法抵抗Hook效應的能力較弱，極易產生假陰性的錯誤結果，從而影響臨床判斷。而靈長類肝臟組織切片由于種屬差異性，可耐受極高濃度的ANA，進而輔助判斷HEp-2細胞的結果是否正常（如組織切片為有強熒光，HEp-2為弱熒光或無熒光，則可能存在Hook效應，樣品需要稀釋后檢測），從而擴充抗核抗體的可檢測范圍，顯著提升檢測方法的抗Hook效應干擾能力。另一方面是因為不同基質對于ANA中的特異性抗體的反應能力不同，比如抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗著絲點抗體和抗增殖性細胞核抗原抗體在肝臟組織中產生的熒光顯著弱于HEp-2細胞。根據(jù)此類差異，可以通過比較相同樣品在兩種基質中的差異，來高效地輔助判斷熒光核型。
熙寧生物|精翰生物擁有豐富的血清或尿液樣品，可提供與SLE相關生物標志物的檢測方法開發(fā)、驗證和樣品分析經驗，可提供抗核抗體滴度、抗核抗體譜、細胞因子、補體因子、補體溶血活性、血/尿生化、凝血功能、尿液自身抗體等一系列的藥效學分析服務，歡迎后臺留言咨詢。
參考文獻：
[1]Wang L , Wang F S , Gershwin M E .Human autoimmune diseases: a comprehensive update[J].Journal of Internal Medicine, 2015, 278(4):369-395.DOI:10.1111/joim.12395.
[2] Israeli E .TLR7 gain-of-function genetic variation causes human lupus[J].The Israel Medical Association journal: IMAJ, 2022(7):24.
[3] Fillatreau S , Manfroi B , Drner T .Toll-like receptor signalling in B cells during systemic lupus erythematosus.[J].Springer Science and Business Media LLC, 2021(2).DOI:10.1038/S41584-020-00544-4.
[4] Sandling J K , Pucholt P , Rosenberg L H ,et al.Molecular pathways in patients with systemic lupus erythematosus revealed by gene-centred DNA sequencing[J].BMJ Publishing Group, 2021(1).DOI:10.1136/ANNRHEUMDIS-2020-218636.
[5]李永珍綜述,吳小川審校.2021—2022年度系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究進展盤點[J].中國當代兒科雜志, 2023, 25(8):785-790.
[6] Fillatreau S .Antibodies against type I IFN: The bad guys self-restrain in systemic lupus erythematosus[J].Cell reports. Medicine, 2023(1).DOI:10.1016/j.xcrm.2022.100903.
[7] Antonios P , Miriam W , Edward M. V .Emerging concepts of type I interferons in SLE pathogenesis and therapy[J].Nature reviews. Rheumatology, 2022, 18(10):575-590.
[8] Hochberg M C .Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.[J].Arthritis Rheum, 2010, 40(9):1725-1725.DOI:10.1002/art.1780400928.
[9] Petri M , Orbai A M ,Graciela S Alarcón,et al.Derivation and validation of the Systemic Lupus International Collaborating Clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus[J].Arthritis & Rheumatology, 2012, 64(8):2677-2686.DOI:10.1002/art.34473.
[10] Tedeschi S K , Johnson S R , Boumpas D T ,et al.Multicriteria decision analysis process to develop new classification criteria for systemic lupus erythematosus[J].Annals of the Rheumatic Diseases, 2019.DOI:10.1136/annrheumdis-2018-214685.
[11] Aringer, Martin, et al. “Advances in SLE Classification Criteria.” Journal of Autoimmunity, vol. 132, 2022, p. 102845.
[12]曾小峰,陳耀龍.2020中國系統(tǒng)性紅斑狼瘡診療指南[J].中華內科雜志, 2020(3):172-185.DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2020.03.002.
[13]Diogo JesusAna MatosCarla HenriquesMargherita ZenMaddalena LarosaLuca IaccarinoJosé António Pereira Da SilvaAndrea DoriaLuís Sousa Inês.Derivation and validation of the SLE Disease Activity Score (SLE-DAS): a new SLE continuous measure with high sensitivity for changes in disease activity[J].Annals of the Rheumatic Diseases: A Journal of Clinical Rheumatology and Connective Tissue Research, 2019, 78(3).
[14]胡朝軍,陳華,王立,等.體檢人群中自身抗體篩查的臨床意義[J]. 2014.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2014.11.012.
[15] Kumar Y , Bhatia A , Minz R W .Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: A journey revisited[J].Diagnostic Pathology, 2009, 4(1, article 1):1.DOI:10.1186/1746-1596-4-1.
[16]胡朝軍,周仁芳,張蜀瀾.抗核抗體檢測的臨床應用專家共識[J].中華檢驗醫(yī)學雜志, 2018(4).
[17]International consensus on ANA patterns (ICAP): the bumpy road towards a consensus on reporting ANA results[J].Autoimmunity Highlights, 2016, 7(1):1-8.DOI:10.1007/s13317-016-0075-0.
