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熙寧小課-第194期 | 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）在腫瘤疫苗藥效評估中的經(jīng)驗(yàn)分享和難點(diǎn)解析
近日默沙東與 Moderna 聯(lián)合公布了個體化 mRNA 癌癥疫苗 mRNA-4157 聯(lián)合抗 PD-1 單抗 Keytruda 用于完全切除術(shù)后的高危黑色素瘤（III/IV 期）患者的 IIb 期 KEYNOTE-942/mRNA-4157-P201 研究的中位 5 年隨訪數(shù)據(jù)。研究的主要終點(diǎn)無復(fù)發(fā)生存期（RFS）顯示出有臨床意義的持續(xù)改善，與 Keytruda 單藥治療相比，聯(lián)用組將復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險降低了 49%（HR=0.510；[95% CI, 0.294-0.887]；p=0.0075）。安全性特征與此前報告保持一致。在術(shù)后輔助治療領(lǐng)域，腫瘤疫苗聯(lián)合PD1免疫治療方案相對于免疫治療單藥方案呈現(xiàn)碾壓式的生存獲益，預(yù)示著腫瘤疫苗即將引領(lǐng)創(chuàng)新藥物的時代潮流。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡稱ELISPOT）是疫苗臨床藥物研發(fā)細(xì)胞免疫學(xué)評估中最為敏感的檢測方法，也是腫瘤疫苗領(lǐng)域必須檢測項，其重要性不言而喻。
然而，在疫苗臨床研發(fā)階段，ELISPOT檢測技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞免疫評估有較多的難點(diǎn)：全血分離PBMC時效要求高、前處理流程復(fù)雜、PBMC樣品不穩(wěn)定、分析批質(zhì)控體系不健全、數(shù)據(jù)分析和解讀困難、陽性結(jié)果不易呈現(xiàn)等。
本期文章，筆者將基于熙寧生物|精翰生物（以下簡稱熙寧丨精翰生物）腫瘤疫苗ELISPOT檢測豐富的項目經(jīng)驗(yàn)，解析和分享ELISPOT檢測的難點(diǎn)和項目管理要點(diǎn)。
熙寧|精翰生物有超過20個腫瘤疫苗臨床項目在同時進(jìn)行，涉及到多種藥物形式，多種載體和多個技術(shù)方向?；谪S富的項目經(jīng)驗(yàn)，匯總了腫瘤疫苗項目臨床生物分析的主要內(nèi)容，如下圖所示：
圖1 熙寧|精翰生物腫瘤疫苗項目臨床生物分析的主要內(nèi)容
腫瘤疫苗作為復(fù)雜藥物形式的代表，同時可能涉及到藥物聯(lián)用，需要多樣化的生物分析技術(shù)進(jìn)行疫苗效果和疫苗作用機(jī)理的全方位評估，生物分析內(nèi)容簡單總結(jié)如下：
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ELISPOT為腫瘤疫苗評估必檢項目，F(xiàn)ACS TBNK或者更復(fù)雜的細(xì)胞分型/MSD多因子通常二選一，以滿足相關(guān)法規(guī)兩種免疫學(xué)評估方法的要求。
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PEG ADA跟mRNA遞送載體 相關(guān)，TAA ADA和表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)，有一半的概率會測。
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LNP PK和qPCR mRNA PK有一半的概率會測，基于藥物載體的成熟程度。
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PD1聯(lián)用通常會測PD1抗體 ADA但不測PK，部分臨床會進(jìn)行IHC PDL1的檢測。
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腫瘤相關(guān)疫苗，特別是KRAS/EGFR突變疫苗會檢測HLA分型，病毒相關(guān)腫瘤疫苗會測qPCR或者IHC測病毒陽性，作為重要的篩選入組指標(biāo)。
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作為回顧性藥效指標(biāo)，會涉及到循環(huán)腫瘤ctDNA，血清腫瘤生物標(biāo)志物和MRD的測量，對于術(shù)后輔助治療應(yīng)用場景，可能作為關(guān)鍵的替代終點(diǎn)，需持續(xù)關(guān)注技術(shù)成熟度和法規(guī)認(rèn)可度。
熙寧|精翰生物基于一體化的檢測平臺可提供上述所有檢測項的檢測服務(wù)，同時有豐富的項目管理經(jīng)驗(yàn)，和不同檢測項的結(jié)果關(guān)聯(lián)解讀經(jīng)驗(yàn)。
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基本原理是通過免疫細(xì)胞和對應(yīng)的刺激物進(jìn)行共培養(yǎng)，然后使用類似于ELISA雙抗夾心法對有刺激反應(yīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測。由于免疫細(xì)胞激活機(jī)理的復(fù)雜性，根據(jù)免疫細(xì)胞的來源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會衍生出不同應(yīng)用方向，不同靈敏度的ELISPOT檢測方法，其簡要的流程如圖2所示：
圖2 ELISPOT技術(shù)基本操作流程
圖3 基于ELISPOT的腫瘤疫苗響應(yīng)者與無響應(yīng)者無復(fù)發(fā)生存率對比
如圖3所示，腫瘤疫苗有響應(yīng)者相對于無響應(yīng)者，有非常顯著的臨床獲益，其中響應(yīng)或者無響應(yīng)的界定標(biāo)準(zhǔn)為ELISPOT檢測項的結(jié)果是否為陽性，ELISPOT檢測是腫瘤疫苗的藥效動力學(xué)指標(biāo)，也是患者分層分析和預(yù)后指示的有效生物標(biāo)志物。
圖4 T細(xì)胞對新抗原肽庫的免疫應(yīng)答
在腫瘤疫苗的臨床生物分析中，ELISPOT檢測是技術(shù)難度較高的一項，同時也容易因樣品質(zhì)量問題導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺失。如圖4所示，mRNA-4157 (V940) 披露的ELISPOT檢測結(jié)果中22個受試者有7個受試者樣品數(shù)量或者質(zhì)量不好；剩余的受試者中5/15有ELISPOT響應(yīng)；有響應(yīng)的5個受試者，有4個疾病得到了控制。
從mRNA-4157 (V940)披露的ELISPOT檢測結(jié)果，結(jié)合其近期披露的IIb 期臨床結(jié)果，對比我司在同類型腫瘤疫苗項目上ELISPOT檢測項中陽性結(jié)果響應(yīng)率情況，初步判斷為mRNA-4157 (V940)的ELISPOT檢測結(jié)果低估了最終的臨床效果，根本原因是樣品質(zhì)量大部分不合格，ELISPOT技術(shù)在臨床樣品分析領(lǐng)域應(yīng)用和轉(zhuǎn)化難度高。
熙寧|精翰生物在腫瘤疫苗評估ELISPOT項目中，做到了全流程管理。在個性化腫瘤疫苗，腫瘤相關(guān)抗原疫苗和病毒來源抗原腫瘤疫苗項目中，均獲得了遠(yuǎn)高于mRNA-4157 (V940)的ELISPOT陽性率結(jié)果。同時做出了細(xì)胞免疫的藥效動力學(xué)趨勢，并跟給藥劑量和給藥周期匹配，不同受試者的整體趨勢相對一致，在ELISPOT檢測項臨床生物分析領(lǐng)域?yàn)樾袠I(yè)內(nèi)最優(yōu)秀的團(tuán)隊，部分檢測結(jié)果示意圖如下。
圖5 個性化腫瘤疫苗，3個受試者的ELISPOT檢測結(jié)果趨勢
圖6 病毒來源腫瘤治療疫苗，1個受試者4個不同抗原的ELISPOT檢測結(jié)果趨勢
圖7 TAA/TS腫瘤治療疫苗，3個受試者3個不同抗原表位的ELISPOT檢測結(jié)果趨勢
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熙寧|精翰生物每個月有400管以上的時效全血ELISPOT樣品進(jìn)行PBMC分離，有豐富的時效全血樣品管理經(jīng)驗(yàn)；
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有超過40個ELISPOT檢測項目在運(yùn)轉(zhuǎn)，有豐富的腫瘤疫苗相關(guān)的臨床項目檢測經(jīng)驗(yàn)，能夠?qū)?shù)據(jù)的整理趨勢有系統(tǒng)性的把握和解讀；
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大部分感染性疫苗/腫瘤疫苗管線均做出來了細(xì)胞免疫藥效動力學(xué)趨勢，并跟給藥劑量和給藥周期匹配，不同受試者的整體趨勢相對一致。
基于大量臨床項目的管理ELISPOT技術(shù)用于臨床樣品分析有以下難點(diǎn)要點(diǎn)，以及對應(yīng)我司的解決方案。
難點(diǎn)1
全血需8小時以內(nèi)分離PBMC才能確保完整的功能活性，中心醫(yī)院和臨床CRC沒有熟練的技能和設(shè)備支持全血分離PBMC。
熙寧|精翰生物解決方案：開發(fā)了全血穩(wěn)定劑，可將全血放置時間延長到48小時，將全血48小時內(nèi)寄送到精翰進(jìn)行分離。全血放置穩(wěn)定性經(jīng)過了正式方法學(xué)驗(yàn)證，同時經(jīng)歷了超過5000個臨床樣品檢驗(yàn)論證其可靠性。對于腫瘤適應(yīng)癥，臨床中心較多，受試者人員分散，同時采血時間分散，持續(xù)時間長，將全血樣品寄送到精翰進(jìn)行集中分離和管理也是成本效率更優(yōu)的選擇。
圖8 熙寧|精翰生物自主ELISPOT方法學(xué)全血放置穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
難點(diǎn)2
全血分離PBMC不能經(jīng)過凍存，需要新鮮進(jìn)行檢測，中心醫(yī)院無技術(shù)能力和儀器支持，寄送到檢測單位進(jìn)行，物流，分離和檢測均耗時耗力，檢測人員需要通宵進(jìn)行試驗(yàn)，項目管理模式不可持續(xù)，人員流動性大，組織結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。同時隨到隨檢，成本高昂。
熙寧|精翰生物解決方案：開發(fā)了PBMC液氮凍存穩(wěn)定性技術(shù)，PBMC可放置在液氮環(huán)境保存，有1年的穩(wěn)定性，PBMC液氮凍存穩(wěn)定性經(jīng)過了正式方法學(xué)驗(yàn)證，同時在研發(fā)階段對比過新鮮檢測和凍存檢測結(jié)果可比性，經(jīng)歷了超過5000個樣品檢驗(yàn)論證其可靠性。對于腫瘤適應(yīng)癥來說，可以將同一受試者不同訪視點(diǎn)的樣品集中在同一個分析批檢測，結(jié)果更加可比，性價比更高。同時批量進(jìn)行檢測，通量高，人員作息規(guī)律試驗(yàn)質(zhì)量有保證，組織結(jié)構(gòu)持續(xù)性好，匹配臨床較長的采樣周期，維持檢測結(jié)果長期一致。
難點(diǎn)3
樣品分析過程中無真實(shí)質(zhì)控樣品，僅使用陰性對照作為質(zhì)控，樣品分析的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)非常松，無失敗的可能性，檢測結(jié)果不可控不可比，不同訪視點(diǎn)的數(shù)據(jù)隨機(jī)分布。
熙寧|精翰生物解決方案：精翰基于CEF刺激陽性PBMC設(shè)置了質(zhì)控樣品，并進(jìn)行了定值作為替代質(zhì)控樣品，每個分析批樣品分析均會帶上質(zhì)控樣品，進(jìn)行了較為嚴(yán)格的質(zhì)控，確保不同分析批不同時間點(diǎn)做出的質(zhì)控樣品結(jié)果可比，外推到樣品分析結(jié)果可比。
ELISPOT檢測技術(shù)用于臨床樣品分析，除了滿足定性（陰陽性）判定需求，還需有定量（斑點(diǎn)多少的比較）檢測需求。這需要更加嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證和樣品分析體系對樣品分析的結(jié)果進(jìn)行評估，比如樣品的陰陽性判定閾值LOD，樣品功能活性判定標(biāo)準(zhǔn)MIR等，是一個精密復(fù)雜的體系，需要有完善的體系構(gòu)建。熙寧|精翰生物基于行業(yè)白皮書建立ELISPOT的驗(yàn)證體系，驗(yàn)證體系的數(shù)據(jù)作為樣品分析的核心判定參數(shù)，同時基于臨床樣品分析的實(shí)際情況進(jìn)行了全血放置穩(wěn)定性，液氮凍存穩(wěn)定性相關(guān)的驗(yàn)證，對ELISPOT樣品，從中心采集到最終檢測數(shù)據(jù)匯報和分析，搭建了全流程的管理體系，并取得了優(yōu)效的臨床樣品分析結(jié)果，能夠真實(shí)客觀的代表腫瘤疫苗藥物在人體的細(xì)胞免疫情況，歡迎咨詢。
圖9 熙寧|精翰生物ELISPOT自主方法學(xué)驗(yàn)證主要參數(shù)
