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溶瘤病毒治療（oncolytic virus，OV）作為腫瘤免疫治療的一種方法，主要通過激活機體自身免疫系統和裂解腫瘤細胞來發揮作用。近年來，隨著研究的不斷深入、技術的不斷發展和指導原則的持續規范，研究者們不斷提高溶瘤病毒對腫瘤的靶向性，降低其對正常細胞的影響，提高安全性。基于溶瘤病毒具有多重機制的優勢，以及與免疫療法聯合的重大機遇，越來越多的溶瘤病毒產品走向臨床階段。
本文基于溶瘤病毒類藥物的研發進展和臨床現狀，結合已獲批上市溶瘤病毒藥物和臨床階段已公布的研究數據，對溶瘤病毒類藥物的臨床生物分析內容和策略展開分享。
1.溶瘤病毒類藥物臨床生物分析內容
根據《溶瘤病毒類藥物臨床試驗設計指導原則（試行）》，溶瘤病毒類藥物在臨床研究中需要進行藥代動力學研究， 包括生物分布、病毒排出及感染性分析和表達產物定量；免疫原性研究，需監測溶瘤病毒載體及表達產物的免疫反應；此外，還應該對療效相關的生物標志物，相關免疫細胞和細胞因子變化進行研究。
圖1. 溶瘤病毒類藥物臨床生物分析主要內容
1.1生物分布和脫落
生物分布反映了藥物進入人體后向各組織器官轉運、代謝及蓄積的情況，病毒脫落為溶瘤病毒通過患者的分泌物 (尿液、唾液、汗液、鼻咽液等) /排泄物 (糞便等) 進行的散播。病毒脫落不同于生物分布，更側重于病毒向第三方或對可能的環境風險的評估，考察病毒的脫落有助于指導臨床研究中長期不良反應的監測。溶瘤病毒分布和脫落通常采用qPCR方法測定溶瘤病毒DNA的拷貝數，檢測樣本包括血液、尿液、腫瘤組織、唾液、注射表面拭子、封閉敷料拭子、口腔黏膜拭子、肛門拭子等。
溶瘤病毒在使用過程中的潛在擔憂是病毒在人與人之間的傳播，醫護人員、密切接觸者等。因此，需要對qPCR檢測陽性的樣本進行感染能力的檢測，采用在經驗證的50%組織培養感染劑量（TCID50）的檢測感染性病毒，該方法可量化在50%接種的組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒量。
圖2.溶瘤病毒臨床試驗中病毒脫落檢測（開展脫落研究數目、脫落檢測樣本類型及檢測方法）
如圖2所示，Nicholas Macedo等人對已報告的97項溶瘤病毒臨床研究進行分析，其中71項試驗（73.2%）進行了溶瘤病毒的脫落研究，最常見檢測部位和樣本為血液，其次是尿液和腫瘤組織樣本，另外有唾液、口腔拭子、痰液，腦脊液、注射部位等。在所有評估溶瘤病毒脫落的71項研究中，最常見是使用PCR方法檢測特定的病毒基因組序列（58項，81.7%），斑塊檢測則作為PCR檢測的補充用于脫落檢測陽性樣本的感染性分析（12項，16.9%）。
研究項目 | 具體實驗內容 |
Samples | ? Blood, Urine, Swabs from the exterior of occlusive dressings, surface of injected lesions, oral mucosa, anogenital area, and lesions of suspected herpetic origin. |
Biodistribution and Shedding | ? Samples were tested for T-VEC DNA using a validated T-VEC–specific quantitative polymerase chain reaction (qPCR)–based assay (no detection of non-target nucleic acids, including wild-type HSV-1 and HSV-2). ? The lower limit of quantification (LLOQ) of the assay (copies of T-VEC DNA/μg total DNA) is 1.76 for blood, 24 for urine, and 18 for swabs. |
Infectivity | ? qPCR-positive swab samples were tested for infectious virus in the validated 50% tissue culture infective dose (TCID50) assay, which quantifies the amount of virus required to create a cytopathic effect in 50% of inoculated tissue culture cells. ? Virus titer was calculated as TCID50/mL; the LLOQ for the TCID50 assay is 5,940 TCID50/mL in swab samples. |
HSV seropositive | ? At baseline, 40 patients (67%) were seropositive for HSV-1, and 20 (33%) were seropositive for HSV-2. |
表1：T-VEC在黑色素瘤患者臨床試驗中的生物分布、脫落和傳播性檢（EBioMedicine 47 (2019) 89–97）
1.2表達產物檢測
溶瘤病毒攜帶的功能基因片段，在體內通過表達產物發揮藥效作用。為了增強機體的免疫應答能力，溶瘤病毒可以攜帶某些增強機體免疫能力的基因及其表達產物，如細胞因子IL-12、IFN-γ、GM-CSF，趨化因子CCL5和HSP等；為阻止腫瘤細胞的免疫逃逸，可攜帶免疫抑制基因及表達產物，如抗PD-1/L1、抗CTLA-4基因等，最終達到調節免疫能力和清除腫瘤細胞的目的。
溶瘤病毒基因表達產物檢測能夠為臨床劑量選擇提供最直接的證據支持。基因表達產物水平過低將無法達到藥效劑量水平，過高將可能帶來額外的安全風險。基因表達產物水平的長期監測將為臨床有效性和安全性提供支持。基因表達產物水平的監測不僅僅限于濃度水平，更需要在功能水平進行監測，是否對攜帶基因進行修飾，基因表達產物和天然產物是否存在差異，功能活性是否相似，表達產物檢測時是否需要排除內源性干擾。此外，溶瘤病毒基因表達產物水平較低，往往需要較高靈敏度的檢測方法。
1.3免疫原性分析
針對溶瘤病毒的免疫反應是溶瘤病毒類藥物臨床試驗中重要的檢測項。如圖3所示，Nicholas Macedo等人總結了溶瘤病毒臨床試驗中報告體液免疫和溶瘤病毒細胞特異性免疫應答的研究數量。在評估的97項研究中，63項（64.9%）的進行了抗病毒抗體滴度的測量，其中27項（27.8%）評估了中和抗體，其余研究評估結合抗體滴度。溶瘤病毒特異性T細胞反應的評估不太常見，僅在10項（10.3%）臨床試驗中報告。
圖3.溶瘤病毒臨床試驗中病毒體液免疫和細胞免疫檢測
溶瘤病毒通常為局部注射，通過直接裂解腫瘤和激發人體的免疫系統協同發揮藥理學作用，機體產生對于溶瘤病毒的病毒載體的體液免疫可以限制病毒載體在人體中的擴散，某種意義來說是安全性指標，通常體液免疫原性檢測只用于病人用藥后的監測。
此外，靜脈注射為更大范圍的腫瘤組織靶向、更廣泛的溶瘤病毒藥物傳播、以及更便捷的注射方式提供了更有效的途徑，成為僅次于瘤內注射的給藥方式。然而，機體對溶瘤病毒載體預存的體液免疫會影響發生中和抗體反應，阻止藥物進入細胞內，降低轉染效率進而降低藥效，進行影響到藥物的有效性。在給予治療后，機體經過適應性免疫應答也會產生特異性結合抗體，影響給藥次數和給藥間隔。
體液免疫反應主要有兩種類型，結合抗體或中和抗體。中和抗體與溶瘤病毒結合并通過多種機制抑制病毒載體轉導靶細胞。非中和抗體與溶瘤病毒結合并在不阻斷溶瘤病毒轉導的情況下“標記”病毒。對于體液免疫原性，檢測的內容包括抗病毒載體結合抗體/總抗體、抗病毒載體中和抗體和抗表達產物抗體。LBA法可用于檢測抗病毒載體總抗體，細胞法用于檢測抗病毒載體中和抗體。
如圖4所示，對于結合抗體，一般可用商業化的病毒衣殼蛋白或溶瘤病毒藥物作為捕獲試劑，結合待測樣品中的抗病毒載體抗體，再利用通用二抗進行顯色反應，用滴度值評價抗病毒載體抗體的水平，通過比較溶瘤病毒給藥前后抗體滴度水平的變化來評價抗病毒載體抗體的產生情況及相對濃度水平。
圖4. 結合抗體/總抗體檢測方法
相對于結合抗體檢測，中和抗體更加具備生理學意義的同時，在臨床生物分析過程中方法學開發，驗證和數據解讀也會變得更加復雜。在臨床生物分析實踐過程中，通常會采用表達CMV-Luc的假病毒用來模擬基因治療藥物的病毒載體或者真實病毒，假病毒和被模擬替代的病毒有類似的衣殼蛋白或者關鍵侵染細胞的蛋白。假病毒和待測血清樣品孵育，加入靶細胞中，如果假病毒能夠感染細胞，將會表達luciferase，加入檢測試劑后會出現信號值，血清未起到阻斷假病毒感染細胞的生理學作用。如果加入檢測試劑后會出現信號值，血清中存在中和抗體，阻斷了假病毒能夠感染細胞，人血清中中和抗體的強度和信號值呈負相關，通過血清樣品檢測信號值的轉化計算，可以獲得血清樣品中抗基因治療藥物病毒載體的中和抗體滴度值。檢測原理和檢測體系如圖5所示：
小課｜流式細胞術在臨床PD檢測的應用——組蛋白乙酰化水平的方案設計考量圖5. Ad5溶瘤病毒的中和抗體檢測
對于細胞免疫原性（圖6），檢測的內容包括針對溶瘤病毒載體T細胞應答和針對表達產物抗體T細胞應答，一般通過酶聯免疫斑點檢測（ELISpot）。ELISpot是通過將溶瘤病毒載體抗原或表達產物抗原與PBMCs共同孵育后，對抗原刺激的干擾素γ（IFN-γ）分泌細胞進行檢測和定量，1個斑點代表1個活性細胞，從而計算出針對特異性抗原分泌IFN-γ起反應的細胞數。
圖6. ELISPOT檢測細胞免疫原型
1.4藥效學分析
溶瘤病毒類藥物通常具有雙重作用機制，以T-VEC為例，首先直接感染和殺死腫瘤細胞（溶瘤作用），其次通過誘導局部和全身免疫反應（免疫治療效應）。T-VEC 通過局部注射到黑色素瘤的皮膚、皮下或淋巴結部位給藥，在腫瘤細胞內復制T-VEC，HSV溶瘤病毒的復制導致被感染的腫瘤細胞裂解，然后釋放可溶性腫瘤相關抗原、危險信號和壞死腫瘤細胞片段，所有這些都有助于啟動局部免疫反應。GM-CSF的局部表達進一步增強了樹突狀細胞的遷移和成熟，然后樹突狀細胞行進到淋巴結區域，將抗原呈遞給特定的 CD4+T 輔助細胞和 CD8+T 效應細胞，觸發全身性 T 細胞反應。
對于此過程中相關的細胞因子、特異性T細胞反應，可使用Luminex，MSD，EnVision，Simoa，流式細胞術等方法進行檢測。
2.小結
溶瘤病毒類藥物的臨床生物分析對于溶瘤病毒類藥物的有效性和安全性至關重要。隨著 T-VEC 的上市以及在更多的臨床試驗中取得的積極結果，溶瘤病毒作為一種新興的腫瘤治療手段在腫瘤免疫治療領域表現出較好的應用前景。近年來，越來越多的研究者開始探索將一些新的病毒載體用于腫瘤治療，并不斷嘗試新的基因修飾以平衡抗腫瘤免疫應答和免疫原性，以及探索不同的給藥途徑、新的病毒遞送方式、與化療藥或免疫檢查點抑制劑的聯合用藥等。相信隨著溶瘤病毒研究的不斷深入，以及溶瘤病毒臨床生物分析領域研究經驗的不斷積累，溶瘤病毒療法在治療人類疾病中將會發揮更廣泛、更深入的作用。
熙寧生物基于對溶瘤病毒類藥物特征的充分了解，具有豐富的臨床樣品分析實踐經驗，配備全面的臨床生物分析技術平臺，可提供臨床前、IIT和臨床階段溶瘤病毒類藥物全流程、一體化的生物樣品分析服務，歡迎大家后臺留言咨詢交流。
3.熙寧生物
熙寧生物是一家以分析科學為核心能力，專注于為生物新藥臨床與臨床前研究提供專業技術服務的創新型CRO企業。公司主營業務包括符合國際GLP&GCP質量管理規范的生物分析(Bioanalysis，BA)服務，伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產品開發服務，以及臨床前藥理藥效研究(Pre-clinical Pharmacology)服務。
基因治療領域作為新興的療法，近些年得到了快速的發展，熙寧生物也積累了豐富的經驗，和專業的技能服務能力，能夠滿足申辦方的生物分析需求。熙寧生物搭建了滿足基因治療藥物的臨床檢測需求和藥物聯用的基因檢測平臺，細胞/病毒檢測平臺，流式檢測平臺和免疫檢測平臺；通過qPCR/ddPCR技術，細胞中和抗體檢測技術，ELISPOT細胞免疫原性檢測技術，流式檢測技術，ELISA/MSD檢測技術等齊備的技術互聯；能夠實現通過一支技術團隊，在一個生物分析實驗室，為一個臨床項目，提供基因治療產品臨床生物分析的完整解決方案。
4.參考文獻
?Clinical landscape of oncolytic virus research in 2020
?Biodistribution, shedding, and transmissibility of the oncolytic virus talimogene laherparepvec in patients with melanoma
?Pharmacokinetic drug evaluation of talimogene laherparepvec for the treatment of advanced melanoma
?Oncolytic viruses challenges and considerations in an evolving clinical landscape
?ICH Considerations Oncolytic Viruses international conference harmonization technical requirements registration pharmaceuticals human use
?《溶瘤病毒類藥物臨床試驗設計指導原則（試行）》
?《溶瘤病毒產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》
