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前言
細(xì)胞因子是一類(lèi)維持機(jī)體自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)定并調(diào)控生理病理過(guò)程的重要因子，不同的細(xì)胞因子在體內(nèi)會(huì)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，若調(diào)控出現(xiàn)失衡，則有可能出現(xiàn)多種疾病。對(duì)細(xì)胞因子的檢測(cè)和及時(shí)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以幫助及早發(fā)現(xiàn)、診斷、對(duì)癥治療相關(guān)疾病，也是個(gè)性化治療、精準(zhǔn)醫(yī)療、合理用藥的重要內(nèi)容。
細(xì)胞因子的定義和功能特點(diǎn)
細(xì)胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)免疫細(xì)胞以及一些非免疫細(xì)胞合成分泌產(chǎn)生的分子量相對(duì)較低的可溶性蛋白質(zhì)，分子量通常在6-70kD，大多數(shù)在15-30kD之間。
從功能上來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子能在細(xì)胞間傳遞信息，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體而發(fā)揮生物學(xué)作用。總體而言，其生物學(xué)活性十分廣泛，參與人體多種重要的生理功能，例如調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、損傷組織修復(fù)等。
從作用特點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子通常是由抗原等刺激物激活相關(guān)細(xì)胞才合成和分泌，其合成和分泌的過(guò)程也是一種自我調(diào)控的過(guò)程，在刺激后會(huì)迅速合成，并立即分泌至細(xì)胞外從而發(fā)揮生物學(xué)作用，后續(xù)也會(huì)被迅速降解。刺激消失后合成會(huì)很快停止，也就是說(shuō)，總體而言，細(xì)胞因子作用的窗口期短，半衰期短，敏感性強(qiáng)。在體內(nèi)，細(xì)胞因子主要是以非特異性的方式來(lái)發(fā)揮作用，會(huì)形成非常復(fù)雜的多相性網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，比如多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性等。
細(xì)胞因子檢測(cè)的意義
作為多種疾病的生物標(biāo)志物，細(xì)胞因子的檢測(cè)在很多疾病領(lǐng)域都有重要的意義，尤其是在感染類(lèi)疾病、惡性腫瘤和自身免疫類(lèi)疾病上。在感染類(lèi)疾病中，細(xì)胞因子可以用于診斷早期感染、膿毒癥的快速篩查、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的篩查、鑒別G-/G+菌感染、評(píng)估病毒感染患者的病情嚴(yán)重程度等。惡性腫瘤方面，細(xì)胞因子可以用于評(píng)估腫瘤微環(huán)境進(jìn)展，輔助腫瘤早期診斷、預(yù)測(cè)免疫治療療效以及化療和手術(shù)的預(yù)后預(yù)測(cè)等。在自身免疫性疾病上，細(xì)胞因子在噬血細(xì)胞綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、過(guò)敏性紫癜、自身免疫性肝炎等疾病上均有應(yīng)用。
除了上述三個(gè)疾病領(lǐng)域以外，細(xì)胞因子的檢測(cè)在其它領(lǐng)域也有很多的應(yīng)用，比如輔助篩查流產(chǎn)病因，監(jiān)測(cè)移植排斥與免疫、指導(dǎo)臨床激素和抗炎藥的應(yīng)用，在重癥急性胰腺炎、氣道炎癥、燒傷、以及醫(yī)美領(lǐng)域的應(yīng)用等等。
另外值得單獨(dú)一提的和細(xì)胞因子相關(guān)的就是細(xì)胞因子風(fēng)暴，膿毒癥、重癥感染、噬血細(xì)胞綜合征、腫瘤免疫治療、罕見(jiàn)變異病毒感染或大手術(shù)患者均可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子可以為及時(shí)治療和預(yù)警細(xì)胞因子風(fēng)暴風(fēng)險(xiǎn)，幫助區(qū)分細(xì)胞因子風(fēng)暴的免疫狀態(tài)提供很大的幫助，提高患者治療的有效率。在CDE發(fā)布的藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則中，也有對(duì)免疫調(diào)節(jié)類(lèi)藥物進(jìn)行細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)的要求，以提前對(duì)免疫調(diào)節(jié)類(lèi)藥物造成的細(xì)胞因子釋放風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行考察。
細(xì)胞因子檢測(cè)的影響因素和難點(diǎn)
靈敏度要求高
大部分的細(xì)胞因子在體內(nèi)的含量是非常低的，通常在pg/mL的水平上，正常人有時(shí)甚至?xí)趂g/mL的水平上，例如IL-2，IL-4。患者體內(nèi)的細(xì)胞因子濃度可能會(huì)有所增加，不同的疾病類(lèi)型，細(xì)胞因子的濃度差別也很大。在進(jìn)行檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)時(shí)，我們需要基于分析目的和人群的細(xì)胞因子濃度分布來(lái)確定方法的靈敏度。由于靈敏度的高要求，對(duì)于細(xì)胞因子檢測(cè)的檢測(cè)試劑，主要是細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體的親和力要求還是很高的，使用親和力低的抗體往往達(dá)不到目標(biāo)靈敏度。
缺少標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法
總體而言，細(xì)胞因子的方法也是使用重組蛋白進(jìn)行的相對(duì)定量方法，不管是自建的還是商業(yè)化的試劑盒，在方法性能上，不同的方法差異很大，比如方法的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度和精密度、關(guān)鍵試劑變更或者條件變更時(shí)的穩(wěn)固性等。參照品的選擇在不同的方法也很不相同，所以對(duì)于細(xì)胞因子的方法，不同方法間檢測(cè)結(jié)果的差異往往也很難對(duì)比，也就是很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，這個(gè)也是目前細(xì)胞因子檢測(cè)上經(jīng)常遇到的問(wèn)題，例如在IL-10的檢測(cè)項(xiàng)目上，不同的試劑盒檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果有的在0點(diǎn)幾到幾pg/mL之間，有的在幾十pg/mL，還有的在幾百pg/mL，甚至是同一個(gè)廠商的不同貨號(hào)的試劑盒，結(jié)果差異有時(shí)也很大。所以在選擇細(xì)胞因子的試劑盒時(shí)，也不能僅僅只關(guān)注靈敏度的數(shù)值，關(guān)注細(xì)胞因子方法的樣品檢出率會(huì)更有意義。
基質(zhì)的影響和干擾
從影響細(xì)胞因子定量結(jié)果的因素上來(lái)說(shuō)，除了分析方法的差異，細(xì)胞因子在基質(zhì)環(huán)境中受到的干擾也對(duì)結(jié)果有很大的影響。例如可以和細(xì)胞因子結(jié)合的蛋白、抑制劑和可溶性的細(xì)胞因子受體，也是我們?cè)诜椒ㄩ_(kāi)發(fā)的時(shí)候需要關(guān)注的重點(diǎn)。對(duì)于一些特殊的細(xì)胞因子，在檢測(cè)試劑的選擇上還要有特殊的考量，以區(qū)分基質(zhì)中存在的類(lèi)似結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì)。
一些生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)也可以和檢測(cè)的試劑結(jié)合產(chǎn)生假陽(yáng)性的信號(hào)，比如類(lèi)風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、補(bǔ)體等等。在方法開(kāi)發(fā)時(shí)也要選擇合適的稀釋液和檢測(cè)試劑以消除或減輕這些干擾。另外，生物樣本的處理過(guò)程也可能會(huì)對(duì)結(jié)果有影響，不同的基質(zhì)中細(xì)胞因子的濃度也往往會(huì)有差異。例如TGFβ1、VEGF、TNFα等，在不少文獻(xiàn)中都有報(bào)道，在血清和血漿中檢測(cè)出的濃度是不同的，很可能是由于凝血過(guò)程中血小板活化釋放導(dǎo)致。
細(xì)胞因子的檢測(cè)平臺(tái)
在細(xì)胞因子的檢測(cè)平臺(tái)上，主要是以體外檢測(cè)的平臺(tái)為主，當(dāng)然目前也有一些基于生物傳感裝置的體內(nèi)檢測(cè)平臺(tái)，但大多都還是在較為早期的研究階段。
從主要的體外檢測(cè)平臺(tái)來(lái)說(shuō)，ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa應(yīng)用的較為廣泛，每個(gè)平臺(tái)也有他自身的優(yōu)勢(shì)。ELISA的成本低，可選擇的商業(yè)化試劑盒多，平臺(tái)的普及度高。MSD平臺(tái)靈敏度高，線性范圍寬，而且可以多組分同時(shí)檢測(cè)，樣品用量小。Luminex的靈活性最高，例如Luminex 200理論上最多可以同時(shí)檢測(cè)100種組分。流式的優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行檢測(cè)，而且也可以多組分檢測(cè)。Simoa平臺(tái)則是所有平臺(tái)中靈敏度最高的，可以定量檢測(cè)fg/mL水平的細(xì)胞因子。
從臨床檢測(cè)上來(lái)說(shuō)，目前更多的項(xiàng)目在細(xì)胞因子的檢測(cè)上會(huì)優(yōu)先考慮一些多因子的檢測(cè)平臺(tái)，這個(gè)也是由于疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，單一生物標(biāo)志物很可能不能充分反應(yīng)疾病的狀態(tài)，對(duì)于多個(gè)細(xì)胞因子均采用單獨(dú)檢測(cè)的方式的成本會(huì)很高，對(duì)樣品量的要求也很大，所以多因子的檢測(cè)平臺(tái)會(huì)更有優(yōu)勢(shì)。目前最主要的多因子檢測(cè)平臺(tái)是Luminex和MSD，在靈活組合的同時(shí)也可以保證一定的檢測(cè)靈敏度。
細(xì)胞因子方法開(kāi)發(fā)考察項(xiàng)
對(duì)于細(xì)胞因子的方法而言，最主要的一些考察項(xiàng)包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、個(gè)體基質(zhì)濃度分布、平行性和選擇性、方法的特異性、QC定值、準(zhǔn)確度和精密度、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、穩(wěn)固性和穩(wěn)定性。對(duì)于不同的分析目的，考察項(xiàng)的側(cè)重也可以有所不同。要求比較高的全驗(yàn)證的方法，通常是作為提交監(jiān)管申報(bào)的數(shù)據(jù)檢測(cè)方法，需要盡可能考察的全面一些，對(duì)于探索性的目的，則可以從成本出發(fā)，主要關(guān)注方法的一些關(guān)鍵項(xiàng)，比如平行性、選擇性、準(zhǔn)確度和精密度、穩(wěn)定性。平行性是判斷方法基質(zhì)效應(yīng)的關(guān)鍵，不過(guò)很多細(xì)胞因子由于內(nèi)源性濃度太低，在方法學(xué)階段無(wú)法進(jìn)行平行性測(cè)試，可以先使用選擇性的測(cè)試來(lái)進(jìn)行。對(duì)于稀釋線性和鉤狀效應(yīng)的考察，也可以基于內(nèi)源性的濃度預(yù)測(cè)來(lái)判斷是否有考察的必要。另外，基于成本的考慮，QC定值也可以采取不同的策略，例如和準(zhǔn)確度精密度分析批同時(shí)進(jìn)行。
熙寧|精翰生物自主研發(fā)的細(xì)胞因子方法
熙寧|精翰生物在主流的細(xì)胞因子檢測(cè)平臺(tái)(ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa等)均有布局，積累了大量的細(xì)胞因子檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于常見(jiàn)的細(xì)胞因子也已開(kāi)發(fā)相應(yīng)的自主產(chǎn)權(quán)方法，例如熙寧生物自主研發(fā)的7因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNFα)方法學(xué)，可用于細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)及臨床血清樣品的檢測(cè)，可以為申辦方省去方法學(xué)建立的時(shí)間，并大大減少方法學(xué)和后續(xù)檢測(cè)的試劑成本。
熙寧生物已有生物標(biāo)志物自主產(chǎn)權(quán)方法（部分）
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