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最近GLP-1領域捷報頻傳，諾和諾德司美格魯肽注射液新適應癥在國內申報上市，禮來的GCGR/GIPR/GLP-1R三重激動劑Retatrutide在48周治療時間內幫助肥胖者體重減輕了24.2%。作為降糖與減肥領域的熱門靶點，GLP-1一直保持著市場熱度，引得國內外各大制藥公司競相布局。
GLP-1即胰高血糖素樣肽，屬于腸促胰島素家族，以葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島β細胞分泌胰島素，參與機體血糖穩態調節。人體分泌的GLP-1半衰期很短，僅為1~2分鐘，分泌到血液循環后易被二肽基肽酶4（DPP-4）快速降解而失去促胰島素分泌的活性。GLP-1可減緩胃排空，還可作用于中樞神經系統上的受體，從而降低食欲，最終起到降低血糖與體重的作用。此外，GLP-1藥物在非酒精性脂肪肝、心血管疾病和神經系統疾病治療方面也具有潛在的治療價值。
圖1 GLP-1作用示意圖
為了充分發揮GLP-1的藥效，藥物研發人員在天然GLP-1的基礎上進行相關改造，使其能夠耐DPP-4酶降解，延長其腸促胰島素活性，減少藥物使用的頻率。
在藥物的臨床試驗過程中，PK、ADA、NAb是生物制品生物分析中的關注點，GLP-1藥物也不例外，下面筆者將結合自身的項目經驗，一一來闡述其中的關鍵點。
PK
由于GLP-1的作用靶點是細胞膜上的GLP-1R，GLP-1R屬于G蛋白偶聯受體家族，它的典型特征是具有一個七次跨膜的結構域，這使得重組表達的GLP-1R很難保持和GLP-1的高親和力，難以作為靶蛋白應用到GLP-1的檢測實驗中。GLP-1結構類似藥物的PK通常選擇雙抗夾心的原理進行設計。
GLP-1融合蛋白作為激動劑藥物，臨床用藥劑量相對較低，靈敏度要求通常在幾ng/mL，可使用定制的抗體對或商品化抗體實現PK濃度的檢測。
ADA
可采用橋聯法來設計ADA檢測模式，為了改善藥物耐受，采用酸化解離樣品后經固相包被藥物的載體捕獲ADA，然后將ADA酸洗脫下來的方式進行樣品純化后檢測。純化后的樣品也可采取物理吸附的方式結合到分析板上，然后用標記的藥物作為檢測試劑進行檢測。
圖2 ADA檢測原理示意圖
GLP-1融合蛋白藥物屬于內源性GLP-1的類似物，在ADA檢測中除了常規的篩選→確證→滴度三層級檢測外，還需對在確證實驗中檢測為陽性的樣品進行內源性GLP-1交叉反應實驗，以了解抗藥抗體是否有影響內源性GLP-1的風險。
NAb
基于藥物的作用機理，GLP-1類藥物的中和抗體分析應采用細胞法。
功能細胞株高表達GLP-1R，GLP-1的結合使細胞活化，胞內cAMP 濃度上升，通過下游信號通路，激活熒光素酶報告基因的轉錄，在加入底物后產生化學信號。當中和抗體存在時會阻礙藥物和細胞上的GLP-1R結合，抑制細胞的活化，表現為信號降低。
圖3 中和抗體檢測原理示意圖
熙寧生物|精翰生物有自主知識產權的GLP-1R，GCGR和GIPR報告基因功能學細胞株，具備>50倍以上的信噪比，人血清耐受性和特異性，具備穩定的方法學性能，可服務于臨床中和抗體檢測，臨床前藥物篩選和CMC放行，功能細胞株部分活性數據如下：
GLP-1R報告基因細胞株數據：
Dulaglutide的劑量權限，結果顯示GLP-1R報告基因穩轉細胞株復孔間信號CV非常小，有明顯的上下劑量曲線平臺期，信號窗口S/N為118。
Dulaglutide中和抗體有明顯的抑制Dulaglutide刺激GLP-1R報告基因穩轉細胞株的作用，中和抑制曲線明顯，中和抗體的靈敏度約為150ng/mL，方法學靈敏。
GIPR報告基因細胞株數據：
標準品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP)。結果顯示，含20%混合人血清的反應體系，其基質效應明顯高于含5%和10%混合人血清的反應體系。而含5%和10%混合血清的反應體系結果相差不大。
標準品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP)，對照品為Liraglutide, Human Glucagon(1-29)和Dulaglutide。結果顯示，Liraglutide, Glucagon(1-29), Human和Dulaglutide沒有非特異信號產生，特異性良好。
GCGR報告基因細胞株數據：
標準品為Glucagon(1-29),Human。結果顯示GLP-1R報告基因穩轉細胞株復孔間信號CV非常小，有明顯的劑量依賴信號響應，信號窗口S/N大于100倍。
Glucagon作為刺激劑， Hu1803-9D標準曲線梯度稀釋加入體系中。結果顯示，Hu1803-9D對Glucagon的抑制作用隨Hu1803-9D濃度升高而增大，且在含有5%混合人血清的環境中與培養基組沒有明顯差異。
熙寧生物|精翰生物已為多種GLP-1類藥物提供一站式生物分析服務，包括PK,ADA,Nab等，類型覆蓋GLP-1,GIP和GCGR類似物及多功能蛋白，具備豐富的方法學開發和樣本檢測經驗，歡迎后臺留言咨詢交流。
