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流式細胞術（flow cytometry，FCM）是利用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒同時進行多參數、快速定量分析和分選的高新技術，在臨床樣品分析中，可以支持包括免疫分型/淋巴細胞亞群分析、磷酸化/甲基化/泛素化蛋白、受體占位、胞內因子、微小殘留病監測等多種檢測分析。在淋巴細胞亞群分析中，最普遍常用的指標包括對CD3+T淋巴細胞，CD3+CD4+輔助/誘導T淋巴細胞，CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細胞，CD3-CD19+B淋巴細胞，CD3-(CD16+CD56)+NK淋巴細胞，以及CD3+CD4+CD25+CD127-/low調節性T細胞（Treg）。此外，單核細胞中的CD14+陽性細胞群也會在部分項目中與淋巴細胞亞群相結合，因此共同分析，即TBMNK。
近期，中國醫藥質量管理協會醫學檢驗質量管理專業委員會發布了一篇《淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中應用的專家共識》（以下簡稱《共識》），我們歸納總結了其中的關鍵要點，結合熙寧生物|精翰生物在淋巴細胞亞群檢測眾多項目累積的經驗，做一個簡要梳理，拋磚引玉，歡迎交流討論。
在淋巴細胞亞群檢測中，TBNK推薦的單抗為CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，Treg檢測的單抗為CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T細胞標記為CD3+，CD4+T細胞標記為CD3+CD4+，CD8+T細胞標記為 CD3+CD8+，B細胞標記為CD3-CD19+，NK細胞標記為CD3-(CD16+CD56)+，Treg細胞的標記為CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127-/low。T細胞表面CD127的低表達與T細胞質內FoxP3的高表達具有良好的相關性，且以CD127為標志進行檢測的方法明顯優于以細胞質內FoxP3為標志的檢測方法[1-3]，因此也可以使用CD127替代FoxP3進行Treg細胞的分析。
使用CD25+FoxP3+和CD25+CD127-/low兩種方式標記Treg，熙寧生物|精翰生物均具有豐富的項目經驗。基于熙寧生物|精翰生物的項目經驗而言，使用CD25+CD127-/low標記Treg的方法可在室溫/2-8℃，兩種儲存條件下穩定儲存12天（days，下文簡稱“D”）；使用CD25+FoxP3+標記Treg的方法可在室溫穩定儲存4D，在2-8℃穩定儲存5D。綜上，使用CD127替代FoxP3標記Treg在方法的穩定性方面具有極大的提升，這與《共識》中的結論也是統一的。熙寧生物|精翰生物使用CD127-/low CD25+標記Treg的部分穩定性數據展示如下：
表1 使用CD127-/low CD25+標記Treg的穩定性數據
注：該方法已經過熙寧生物|精翰生物內部全驗證，可直接支持樣品分析。“CD127-/lowCD25+%” 為CD127-/lowCD25+占父群的比例，即Treg占CD4+T細胞亞群的比例。A，室溫儲存穩定性數據，與基線相比%CV范圍為：0.9%-11.2%。B，2-8℃儲存穩定性數據，與基線相比%CV范圍為：0.3%-10.1%。
淋巴細胞亞群檢測可以通過單平臺法或雙平臺法[4]進行，取樣時，首選乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝真空管采集外周靜脈血標本，并在24h內進行檢測。送檢時間超過30h應該采用肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝，可在室溫下穩定保存至48h，若送檢時間超過48h，應該使用流式細胞檢測專用的樣本保存液或樣本保存管，可穩定保存至14D。熙寧生物|精翰生物已有經過全驗證的TBMNK檢測方法，使用特殊采血管進行樣品采集，可直接用于支持臨床樣本中CD3+T淋巴細胞，CD3+CD4+輔助/誘導T淋巴細胞，CD3+CD8+抑制/殺傷T淋巴細胞，CD3-CD19+B淋巴細胞，CD3-CD16+/CD56+NK淋巴細胞占淋巴細胞的比例，和CD14+單核細胞占單核細胞的比例，及各個細胞亞群在外周血中濃度的檢測。已驗證可在室溫/2-8℃，兩種儲存條件下穩定儲存14D，部分穩定性數據展示如下：
表2 人全血中TBMNK穩定性數據
注：使用特殊采血管采集的人全血，室溫儲存14天后，與基線相比%CV范圍為0.3%-13.8%。
在健康成年人外周血中，T、B、NK及Treg細胞在今年的多項研究中均有發布，針對我國不同地區、年齡等健康人群均提供了相應的參考區間，見下表：
表3 健康成年人外周血TBNK淋巴細胞參考區間
注：我國九省（湖北、河南、廣東、吉林、山東、山西、江蘇、浙江、四川）20~60歲健康成人TBNK淋巴細胞參考區間的研究結果，供參考。
表4 健康成年人外周血Treg細胞參考區間
血液腫瘤作為造血干細胞異常的惡性腫瘤，疾病的多種因素會影響免疫細胞的產生、增殖及分化，使外周血的淋巴細胞數量與功能產生異常，導致免疫功能失調，因此對血液腫瘤患者進行規范的淋巴細胞亞群檢測十分必要。淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤患者中的應用包括以下幾個方面：
1.淋巴細胞亞群分析可以支持部分血液腫瘤的篩查（如急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞增殖性疾病(CLPD)等）
當出現以下情況：
① B或NK淋巴細胞顯著增高；
② CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴細胞明顯增高；
③ CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10；
④ CD3+%+CD19+% +（CD16+CD56）+%明顯大于或小于（100 ± 5）%、CD4+%+CD8+%明顯大于或小于CD3+%（變化范圍為5%~10%）;
在排除標本、儀器、設門、試劑及反應性改變等因素后，需要考慮標本中存在異常淋巴細胞，并結合臨床進行血液腫瘤的篩查。血液腫瘤常見的淋巴細胞亞群改變見下圖：
注：A表示T淋巴細胞群比例增高;B表示B淋巴細胞群比例增高;C表示NK細胞群比例增高;D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴細胞比例之和小于95%，存在不表達CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴細胞;F表示CD4+T、CD8+T淋巴細胞群比例大致正常;G表示CD4+T淋巴細胞群比例降低，CD8+T淋巴細胞群比例增高;H表示CD4+T淋巴細胞群比例增高，CD8+T淋巴細胞群比例降低:I表示中CD4+CD8+T淋巴細胞群比例增高:J表示 CD4-CD8-T淋巴細胞群比例增高。
血液腫瘤淋巴細胞亞群篩查與隨訪路徑見下圖：
注：MICM表示形體學、免疫學、細胞遺傳學及分子生物學分型
2.腫瘤復發、轉移風險預警及預后評估
CD3+、CD4+、CD8+T細胞的數量和比例與患者的完全緩解（CR）率、無復發生存期（RFS）和總生存期（OS）呈正相關，而Treg的數量和比例與CR率、RFS和OS呈負相關 [5-9] 。在AML患者中，NK細胞數量和比例與CR率、RFS、OS呈正相關 [10] 。
3.合并感染風險預警
感染是血液腫瘤患者的常見并發癥，當CD4+T淋巴細胞絕對計數＜500個/μL時，血液腫瘤患者機會性感染風險會大幅升高[11]。初診時Treg細胞比例升高的血液腫瘤患者，其住院期間感染率明顯增加[12]。
4.造血干細胞移植后免疫重建監測及GVHD預防
造血干細胞移植(HSCT)后造血能力持久恢復與免疫系統功能調節密切相關，主要表現為免疫細胞數量的增加和細胞功能狀態的恢復。NK細胞一般移植后2~3周可恢復，CD3+CD8+T淋巴細胞一般移植后1~3月恢復，CD3+CD4+T淋巴細胞恢復通常需要1年以上。CD3-CD19+B淋巴細胞移植后恢復時間不定，短至3個月，長至1年半以上。Treg細胞在移植早期通常比例非常低，移植晚期逐漸增多。
具有負調控炎癥反應功能的Treg細胞隨GVHD等級的增加呈下降趨勢，有望成為預測急性GVHD（發生于移植后100d內）和慢性GVHD（發生于移植100d后）的特異性指標[13-14]。因此異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)患者在早期植入階段（輸注后2~4周）、移植后早期階段（輸注后1~3月）、移植后晚期階段（輸注后3月以后）都建議行淋巴細胞亞群檢測。
5.CAR-T治療患者的規范化管理和評估
定期監測CAR-T治療患者體內的CAR-T細胞水平、腫瘤負荷、免疫功能（主要包括淋巴細胞亞群的比例和數量）和相關不良反應（細胞因子釋放綜合征、神經毒性等），是治療后病情評估的重要手段[15-16]。患者回輸CAR-T細胞后，可通過FCM監測外周血中CAR-T細胞的比例和數量，有條件的實驗室還可開展熒光定量聚合酶鏈反應法（qRT-PCR）監測CAR-T細胞增殖水平。
淋巴亞群檢測也被推薦與CAR-T細胞監測同時進行[16]。有研究通過檢測患者CAR?T細胞回輸后第15天的外周血淋巴細胞水平，發現低水平的淋巴細胞數（<0.67×109/L）是患者的不良預后因素，顯著影響病情緩解[17]。有研究者提出，具有中央記憶T細胞和干細胞樣記憶T細胞表型的CAR-T細胞，在體內有更強的增殖能力及更持久的抗腫瘤效應[18-19]。對于CAR-T細胞治療的患者，有條件的情況下，可以進行CAR-T細胞的精細亞群分析和長期隨訪。
6.血液腫瘤患者藥物治療指導
對于靶向治療B-NHL的CD20單抗，B細胞是否完全清除可以用于評估CD20單抗的治療反應和療效[20-22]。對于免疫功能嚴重受損的患者（經過放化療治療或合并HIV感染等），患者在治療過程中嚴重感染的頻率顯著增加，建議根據患者的CD4+T細胞數量制定治療策略；對于移植及個體化免疫治療患者，則可以參考CD4+/CD8+細胞比值；對于治療期間合并感染的患者，更需要關注NK細胞或者CD8+T細胞。
7.動態監測與隨訪時機的選擇
健康人群的參考區間可能不能有效評估血液腫瘤患者的免疫功能，建議建立患者個體化的淋巴細胞亞群檢測結果的基線，并規律、動態的監測其變化趨勢。血液腫瘤患者常伴有免疫功能失衡，初診時檢測患者的淋巴細胞亞群，有助于判斷免疫功能的初始狀態。放化療、免疫治療及靶向治療期間患者可呈周期性改變，檢測淋巴細胞亞群變化可用于評估患者治療期間免疫功能恢復情況及腫瘤復發和轉移風險。建議在治療結束后半年內每3個月跟蹤檢測，半年后每6個月進行隨訪。造血干細胞移植后患者在移植后第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年隨訪建議檢測淋巴細胞亞群。建議連續監測患者CAR-T細胞回輸前1天、回輸后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴細胞亞群變化情況，及治療后2個月、3個月、6個月隨訪，見下圖：
血液腫瘤淋巴細胞亞群檢測路徑圖
淋巴細胞亞群檢測在血液腫瘤中具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景，通過TBNK、Treg這些指標，可以評估血液腫瘤患者免疫狀況，為疾病診斷、分型，治療方案的選擇、化療后感染預防，疾病轉歸等提供實驗室依據，以及為血液腫瘤患者的個性化治療提供參考。
熙寧生物 | 精翰生物流式團隊由30余名經驗豐富的人員組成，配備BD流式細胞儀、Beckman流式細胞儀、Cytek光譜流式細胞儀等儀器和設備，支持過包括抗體類藥物、基因與細胞治療藥物、小分子創新藥等各類新藥的流式分析檢測，其中抗體藥物>20個，基因與細胞治療藥物>10 個，小分子創新藥>10 個，臨床試驗>40 個，更是支持國內第一款I 類新藥的CAR-T產品- 藥明巨諾倍諾達?（瑞基奧侖賽注射液）的樣本檢測分析工作。平臺能夠支持包括免疫細胞亞群分型檢測，細胞治療產品的PK/PD 分析，抗體藥物的受體占位分析，PD指標蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化檢測，胞內因子檢測等。尤其在血液腫瘤淋巴細胞亞群檢測中具有大量的實戰經驗，歡迎咨詢溝通。
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