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隨著科技的不斷進步，免疫組庫測序方法正為我們提供越來越深入的洞察力，揭示著免疫系統的奧秘。在本文中，我們將深入探討免疫組庫測序的方法和技術，解析其背后的科學原理，以及如何利用這一技術來揭示免疫系統的復雜性。通過了解免疫組庫測序的工作流程和應用，我們可以更好地理解人體免疫系統如何應對病原體侵襲、疾病發展以及免疫相關治療的潛在機制。本文將帶領您深入了解免疫組庫測序方法的精髓，讓我們一起走進這個神奇的科學領域，探尋免疫系統的奧秘之旅！
PART 01
免疫組庫檢測方法
分析免疫系統的傳統方法，如流式細胞術和免疫顯微鏡光譜分型，存在諸多的局限性，費時費力且費用昂貴[1]。
在下一代測序（NGS）技術之前，最常見的分析免疫受體的方法是Sanger測序，但Sanger測序數據通量較低，成本較高，運行時間較長。與Sanger測序相比，NGS可以以更低的成本、更高的通量和更短的運行時間對免疫系統進行更廣泛的檢測，因此，NGS技術成為免疫組庫檢測最常用的技術。NGS免疫組庫測序涉及幾個過程，包括細胞處理、核酸提取、文庫制備、測序和生物信息學分析（圖1）。
圖1 免疫組庫測序和分析過程[1]
PART 02
擴增模板選擇
文庫制備是生成免疫組庫測序純文庫的基礎，文庫制備可以使用gDNA作為模板，使用V和J片段引物，或者使用cDNA作為模板，使用V前導引物、內部V引物、J引物或恒定區引物（圖3）。除了體細胞突變對引物結合的潛在影響相關的考慮因素外，兩種原料模板各有優劣，主要取決于檢測的目標。gDNA與細胞數量成比例相關，因此通常用于計算抗原特異性或靶T/B細胞的比例；而信使核糖核酸與細胞功能/活化密切相關。
gDNA模板的優勢是，它允許分析產生蛋白質產物的有效重排基因序列，以及在V（D）J重排過程中非編碼重排基因序列，非編碼重排基因序列雖然不產生功能蛋白，但提供了Ig基因座重排特征的信息，如基因片段重排頻率、核酸外切酶進行的片段消化以及非模板堿基插入水平。這可用于評估與受體基因重排或B細胞選擇相關的免疫表型，例如免疫缺陷疾病。每個細胞只有一個有效重排的TCR/BCR基因座，因此gDNA可評估細胞群中T/B細胞克隆的大小。相反，在單個T/B細胞內會產生多個mRNA拷貝，并且TCR/BCR重排基因在不同細胞亞群中mRNA表達水平不同，例如在幼稚細胞中表達較低，在漿母細胞中的高表達，意味著如果只有單個RNA樣品可用于分析，則不能可靠地區分具有高TCR/BCR mRNA表達的細胞的存在。然而，使用RNA作為測序起始原料模板還有其他優勢，主要是它能夠鑒定與特定V（D）J重排相關的重鏈類型，RNA模板的另一個潛在優勢是，它保留細胞樣品中存在的T/B細胞克隆的完整性，因為每個B細胞可以貢獻其TCR/BCR重排的多個mRNA拷貝，因此，如果在純化過程中丟失一些模板，樣品中代表的T/B細胞克隆的數量不會像gDNA那樣線性減少。最后，重排的gDNA片段僅占總DNA量的一小部分，而cDNA每ng擴增的模板含有更多可擴增的cDNA模板。由于可以添加到PCR反應中的DNA模板的量是有限的，因此與gDNA模板相比，使用cDNA模板可以用更少的PCR反應得到更復雜的BCR/TCR重排文庫（表1）。
表1 gDNA和mRNA作為文庫擴增原料模板的優劣[1]
PART 03
文庫構建擴增方法選擇
文庫制備的擴增方法也是非常重要的，常用的方法有多重聚合酶鏈式反應（mPCR）和5’RACE。mPCR使用混合引物來捕獲多個區域，引物設計主要集中在框架（FR）區域FR1、FR2和FR3上，該區域的突變相對少于CDR區更少，可能是由于框架（FR）區突變破壞抗體結構穩定，導致B細胞在體內的持久性受到影響。這種擴增方法既可用于gDNA，也可用于mRNA。擴增原理與普通聚合酶鏈式反應相似，只是引物數量增多。但不同引物之間存在效率差異和交叉反應性，導致擴增產物中引入偏差，需要對引物設計和引物濃度進行優化[1]。
5’RACE僅用于捕獲mRNA，一組基因特異性引物能夠與3’端基因片段互補結合，使用V、J或恒定區內的引物，可以最大限度地減少引物偏倚和多重PCR引入的偏差，同時也有利于擴增引物結合位點發生突變的lg序列。然而，對一個基因座上所有V基因片段分析顯示，一些可能具有短的5’非轉錄區（UTR）（短至30bp），而一些可能具有非常長的5’UTR（高達9kb）（圖2，圖3）。因此，通過這種方法制作的文庫可能偏好于較短的序列，這種方法的擴增建庫可能更復雜，需要RNA作為起始材料，缺少基因組DNA重排的分析，檢測性能受限于RNA樣本總量和質量，以及逆轉錄酶的效率。總之，這兩種方法各有優缺點（表2）。
圖2 TCR文庫構建過程[4]
注：(A)多重聚合酶鏈式反應的過程
(B) 5‘RACE的過程
圖3 使用gDNA或cDNA生產IgH文庫[3]
注：上圖顯示了編碼抗體重鏈的重排gDNA。左引物設計在框架1、2或3（FR1、FR2、FR3）區域（用帶圓圈的數字1、2和3標記），互補右引物設計在與J基因片段互補區域（標記4），PCR可擴增VDJ基因重排。左側框架引物組顯示了多個引物，表明擴增不同家族的V片段所需的不同引物。前導肽外顯子通過短內含子與V片段分開。下圖顯示了由編碼重鏈的成熟mRNA產生的cDNA。與恒定區雜交的引物（標記為6）可以用作5’RACE方案的初始特異性引物，或者可以與前導序列中的引物（標為5）或框架引物一起進行PCR，擴增VDJ基因重排。與VDJ基因重排相關的恒定區不同類型可以在該文庫中進行鑒別。
表2 mPCR和5’RACE兩種擴增方法的優劣[1]
免疫組庫測序是一個復雜的過程，需要專業人員操作以便最大限度地減少測序錯誤，在文庫制備和測序中都可能引入錯誤，文庫制備可能會在核酸提取和PCR擴增過程中引入錯誤，而測序錯誤源于不同的測序平臺以及測序上機文庫的濃度和純度。為了減少測序錯誤，可以使用一些校正方法，如聚類算法和獨特的DNA條形碼技術。聚類算法的是通過將相似的序列分組在一起來降低測序誤差，獨特的DNA條形碼技術是添加獨特的分子標簽（UMI），調整PCR過程中的誤差或擴增偏差[1]。
PART 04
其他免疫組庫檢測技術
最近的研究中，RNA-seq也用于研究免疫系統，雖然該方法提供了更全面的基因表達信息，但這種方法并不能提供完整的轉錄組序列，但這對于在更多細胞中鑒定低豐度CDR3序列是必要的，因此，RNA-seq敏感性不足以進行嚴格的免疫組庫分析[1]。另外還有新發展的單細胞測序技術，基于流式細胞術、微流體設備和微孔板來分離單細胞，然后通過具有獨特條形碼的液滴或具有磁珠的乳液制備文庫，進行高通量測序，單細胞分離技術與高通量測序技術相結合，有助于獲得單細胞高通量數據，可以剖析B細胞重鏈：輕鏈和T細胞α鏈：β鏈或δ鏈：γ鏈的配對信息，分析特定疾病抗體庫，但由于單細胞測序檢測成本高、檢測流程繁瑣、數據解讀分析復雜等問題，整體適用范圍有限。
本文我們深入介紹了免疫組庫測序的方法和技術，解析了其在科學研究領域中的重要性和應用。從測序樣本的準備到數據分析的過程，一步步揭示了免疫組庫測序技術的精髓和復雜性，展現了這一技術在揭示免疫系統機制中的不可或缺的作用。
下一篇文章將帶您進入免疫組庫測序在藥物研發中的應用領域，探討免疫組庫測序如何在藥物研發過程中發揮關鍵作用，幫助研發人員更好地理解免疫系統在疾病治療中的作用機制，揭示潛在的藥物靶點和治療策略。
熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，在時序樣本檢測中，通過檢測患者體內TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進展或復發。本檢測方法已經經過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。歡迎您后臺留言咨詢。
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